Puntos de fusión y técnicas de PCR

Contesta las siguientes preguntas y razona la respuesta:

1. Entre dos moléculas de ADN con la misma composición de bases, una con una longitud de 100 pb y otra con una longitud de 200 pb, ¿cuál tendrá mayor punto de fusión (Tm)?
   Al tener las dos moléculas la misma composición de bases y una longitud interior a 500 pb, sólo influye en la Tm la longitud. Por lo tanto, la molécula de 200 pb tendrá mayor Tm.
2. Entre dos moléculas de ADN con una longitud de 5000 pb, una con un 30% de AT y 70% de GC y otra con un 45% de AT y 55% de GC, ¿cuál tendrá menor punto de fusión?
   Al tener las dos moléculas más de 500 pb, el parámetro que más influye en la Tm es la proporción de GC. Por lo tanto, la molécula con el 55% de GC tendrá menor Tm.
3. En un tubo tenemos una solución de una molécula de ADN con una concentración de 5 uM. En otro tubo tenemos una solución de la misma molécula de ADN con una concentración 8 UM. Si usamos estos tubos para sendos experimentos de desnaturalización, aumentando la temperatura y midiendo la absorbancia a 260 nm, ¿en qué tubo obtendremos un valor de T mayor ? Al ser la misma molécula en ambos casos, se obtendrá el mismo valor de T en los dos tubos, porque la Tm no depende de la concentración de la molécula de ADN en el tubo, sino de la composición de bases.

Factores que influyen en la T. de un híbrido en solución

Respecto de los factores que influyen en la T. de un híbrido en solución, tacha lo que no proceda en las siguientes afirmaciones:

Si se aumenta la concentración de formamida en la solución, disminuye la Tm del híbrido.

Si se aumenta la concentración de cationes monovalentes en la solución, aumenta la Tm del híbrido.

Para una misma sonda, un híbrido con un porcentaje de mismatch del 10%, tendrá una Tm menor que un híbrido con un porcentaje de mismatch del 5%.

7. Di si son verdaderas o falsas las siguientes afirmaciones:

a) La mayor eficiencia de hibridación se consigue a temperaturas entre Tm-16 °C y Tm-32 C. Verdadero.

b) La rigurosidad (stringency) de una técnica de hibridación se fija principalmente en los lavados de poshibridación. Verdadero.

c Para fijar condiciones de elevada rigurosidad se utilizan tampones con alta

concentración salina y baja concentración de formamida. Falso

d) Los híbridos de sondas marcadas con fluorocromos se detectan mediante autorradiografía. Falso

8. para cada uno de los marcadores citados a continuación, indica el tipo de marcador que es y como detectarías un híbrido formado por una sonda marcada con el:

digoxigenina: hapteno, método inmunohistoquímico

FITC: Fluorocromo Microscopio de fluorescencia

32P: isotopo radioactivo, autorradiografía

Cy3: fluorocromo, microscopio de fluorescencia

Biotina. Hapteno. Método inmunohistoquímico (estreptavidina marcada con enzima sustrato/cromógeno).

2. Di si son verdaderas o falsas las siguientes afirmaciones:

El dot blot permite detectar secuencias específicas de ADN y ARN y además aporta información sobre el tamaño de la secuencia diana. Falso.

El Southern blot se utiliza para detectar secuencias de ARN y el Northern blot para detectar secuencias de ADN. Falso.

En el dot blot hay que desnaturalizar la muestra antes de aplicarla a la membrana.
Verdadero.

En las técnicas de hibridación sobre membrana, antes de la hibridación hay que
anclar los ácidos nucleicos de la muestra a la membrana mediante calor o
radiación UV para membranas de nailon). Verdadero.

En las técnicas de hibridación en membrana, esta se puede rehibridar varias veces, independientemente del marcador utilizado en las sondas. Falso

5. Respecto de la hibridación genómica comparada (CGH), di si son verdaderas o falsas
las siguientes afirmaciones. Razona la respuesta en el caso de las afirmaciones falsas.

En los estudios de CGH se compara el ADN de una muestra problema con un ADN de referencia. Verdadera.

La CGH permite detectar todo tipo de anomalías genéticas, tanto estructurales (traslocaciones e inversiones), como cuantitativas deleciones y duplicaciones).Falsa. La CGH compara las secuencias de ADN presentes en la muestra problema con las secuencias presentes en el AD de referencia y por ello solo permite detectar pérdidas o ganancias de material genético, es decir, anomalías genéticas cuantitativas deleciones y duplicaciones). En el caso de translocaciones o inversiones, las secuencias implicadas están presentes en el ADN problema en la misma proporción que en el ADN de referencia, aunque estén en una localización cromosómica diferente, por lo que no pueden ser detectadas con esta técnica.

Para su realización se marcan el ADN problema y el ADN de referencia con fluorocromos diferentes. Verdadera.

La hibridación se puede realizar sobre cromosomas en metafase o sobre microarrays. Verdadera.

7. Empareja en tu cuaderno cada tipo o variante de PCR con las enzimas o cebadores que se utilizan en ellas

PCR múltiple - varias parejas de cebadores en la misma PCR

PCR de grandes fragmentos - ADN polimerasa sin actividad correctora más ADN polimerasa con actividad correctora

PCR anidada (nested-PCR) - 2 de valores externos y dos de valores internos. En dos. PCR es consecutivas

Hot Start PCR - ADN polimerasa inactiva hasta que se alcanza la temperatura de desnaturalización por primera vez

RT.PCR - y transcriptasa inversa más ADN polimerasa termoestable

PCR de alta fidelidad - ADN polimerasa con actividad correctora

Completa las afirmaciones sobre la PCR a tiempo real

1. Cuando se usan agentes intercalantes:
   La fluorescencia se mide al final de la fase de hibridación extensión de cada ciclo.
   La fluorescencia aumenta disminuye con el número de ciclos.
2. Cuando se utilizan sondas de hidrólisis o sondas TaqMan:
   La fluorescencia se mide al final de la fase de hibridación /extensión de cada ciclo.
   La fluorescencia aumenta/disminuye-con el número de ciclos.
3. Cuando se utilizan balizas moleculares:
   La fluorescencia aumenta disminuye con el número de ciclos.
   Se excita el notificador-quencher y se mide la fluorescencia emitida por el notificador/quencher.
4. Cuando se utilizan sondas FRET: disminuye
   La fluorescencia se mide al final de la fase de hibridación/ extensión de cada ciclo.
   Se excita el notificador-quencher y se mide la fluorescencia emitida por el notificador / quencher.

Afirmaciones sobre la PCR a tiempo real

1. En la gPCR el punto de corte (Cp) es el ciclo en el que se pasa de la zona de ruido a la zona de crecimiento exponencial en la curva de amplificación. Verdadero.
2. El cp de una muestra es directamente proporcional a la concentración inicial de la molécula diana en la muestra. A mayor concentración inicial mayor Cp. Falso. La relación entre el Cp y la concentración inicial de la molécula diana en la muestra es inversamente proporcional. A mayor concentración inicial de la molécula menor Cp, es decir, se necesitan menos ciclos de amplificación para obtener una cantidad de amplicon superior al límite de detección del termociclador.
3. En la curva de picos de fusión generada por un termociclador a tiempo real se observan tantos picos como productos amplificados con distintas Tm específicos y no específicos se han sintetizado durante la PCR. Falso. La curva de fusión se realiza con agentes Intercalantes, que emiten un máximo de fluorescencia cuando todo el ADN está en doble hélice y va disminuyendo a medida que el ADN se desnaturaliza. Cuando se usan sondas de hidrólisis, estas se van degradando a medida que hibridan con los amplicones en cada ciclo, liberando el fluorocromo notificador a la mezcla de reacción. Al final de la PCR, que es cuando se realiza la curva de fusión, todo el notificador libre emite fluorescencia, mientras que el exceso de sonda que no haya hibridado en ningún ciclo no emite fluorescencia, independientemente de que al realizar la curva de fusión se una o no al amplicón. Por lo tanto, no se pueden realizar curvas de fusión con sondas de hidrólisis