Protocolos de Ingeniería Genética y Técnicas de Biología Molecular

Parte 4: Procedimiento de Clonación y Transformación Genética

En un laboratorio de investigación, se lleva a cabo un proceso para insertar un gen de interés en un organismo (ejemplo: zanahoria para estudios relacionados con el virus de la hepatitis B). A continuación, se detallan los 15 pasos del procedimiento:

1. Búsqueda del gen: Identificar el gen de interés.
2. Caracterización: Investigar sobre el gen y su secuencia nucleotídica.
3. Identificación de marcos de lectura: Determinar los codones de inicio y de término.
4. Digestión enzimática: Utilizar enzimas de restricción (ej. EcoR5, SmaI) para cortar la secuencia.
5. Ligación: Incorporar etiquetas de fusión (His-tag, V5, HA, GFP) utilizando una enzima de unión (T4 ligasa).
6. Clonación: Insertar la secuencia en un vector de clonación para su replicación.
7. Verificación por PCR: Realizar una PCR a los organismos clonados y confirmar mediante electroforesis.
8. Expresión: Transferir los genes clonados a un vector de expresión.
9. Confirmación: Realizar una PCR para verificar la presencia del gen en el organismo.
10. Preparación del vector: Preparar la secuencia para su inserción en el organismo diana (ej. virus de la hepatitis B).
11. Transformación: Utilizar métodos como microinyección o electroporación para introducir el gen.
12. Selección: Sembrar el organismo en un medio axénico específico con antibiótico.
13. Identificación de transformantes: Seleccionar las cepas que sobrevivieron al medio selectivo.
14. Validación final: Realizar una tercera PCR para confirmar la presencia del organismo de interés.
15. Mantenimiento: Conservar el organismo en un medio de cultivo adecuado.

Parte 2: Parámetros de PCR y Purificación de ADN

Ciclos de PCR

• Elongación inicial: 92°C, 5 min (1 ciclo).
• Elongación final: 92°C, 5 min (1 ciclo).
• Hibridación: 65°C, 30 seg (30 ciclos).
• Polimerización: 65°C, 30 seg (1 ciclo).
• Terminación: 65°C, 30 seg (1 ciclo).
• Terminación final: 1 min.

Diagrama de Purificación de ADN (Método de Lisis Alcalina)

1. Cultivo
2. Resuspender pellet
3. Resuspender parte celular
4. Lisar células
5. Neutralizar solución
6. Separación de componentes
7. Precipitar ADN

Soluciones utilizadas:

• Solución 1: Glucosa / Tris / EDTA
• Solución 2: NaOH / SDS
• Solución 3: Acetato de potasio

Cuestionario de Biología Molecular

1. ¿Qué es un vector de expresión?

Es una construcción genética que permite la introducción de un gen exógeno determinado en una célula diana para que esta sea capaz de expresarlo eficientemente. Ejemplos: pBR322, pCMV-Script, SP6.

2. Moduladores de hibridación de ácidos nucleicos

• Temperatura: La temperatura elevada rompe los puentes de hidrógeno y separa las hebras del ADN (desnaturalización).
• pH y productos químicos: Un pH alto (>11) rompe los puentes de hidrógeno, provocando desnaturalización. Agentes químicos como la urea, la formamida e incluso el agua destilada pueden producir este efecto.
• Concentración de sales: Una baja concentración de sales en la solución de hibridación impone una condición de alta astringencia, permitiendo solo uniones de gran complementariedad.