¿Por qué es necesaria la digestión enzimática en tejidos FFPE?

La fijación en formol crea enlaces entre proteínas y otras macromoléculas. La digestión enzimática libera los ácidos nucleicos para que puedan hibridar con la sonda y permeabiliza la muestra.

¿Para qué sirve la prehibridación?

Con una solución que contiene ADN de esperma de salmón fragmentado se bloquean las uniones inespecíficas de las sondas al tejido.

¿Qué enzimas se utilizan en la digestión enzimática?

Las enzimas más utilizadas son la proteinasa K y la pepsina.

Protocolo genérico de hibridación cromogénica in situ (CISH) en tejidos FFPE

Resumen

El texto describe los pasos generales de un protocolo de hibridación cromogénica in situ (CISH) aplicado a tejidos fijados en formol e incluidos en parafina. Explica la preparación del tejido, la digestión enzimática, la prehibridación, la hibridación, los lavados, la detección del híbrido, la contratinción y la visualización al microscopio. Es útil para entender la lógica de cada etapa y su función.

Puntos clave

El primer paso es eliminar la parafina con xilol y rehidratar el tejido con alcoholes en graduación descendente.
La digestión enzimática (proteinasa K o pepsina) libera los ácidos nucleicos de las uniones a proteínas formadas por la fijación en formol.
La prehibridación con ADN de esperma de salmón fragmentado bloquea uniones inespecíficas de las sondas.
Durante la hibridación, sonda y secuencia diana se desnaturalizan a unos 95 °C durante 5-10 minutos, en cámara húmeda.
Las sondas se marcan con haptenos y se detectan mediante inmunohistoquímica indirecta con amplificación de señal.
La contratinción suave permite ver el híbrido en su contexto tisular y celular, y la reacción puede localizarse en núcleo o citoplasma.

Ponte a prueba

Protocolo Genérico para Hibridación Cromogénica in Situ (CISH)

Desparafinado y Rehidratación

Cualquier técnica que se quiera realizar sobre los tejidos FFPE (fijados en formol e incluidos en parafina), requiere como primer paso la eliminación de la parafina y la rehidratación del tejido. Esto se conseguirá realizando sucesivas inmersiones de los portaobjetos con las secciones del tejido en cubetas con disolventes orgánicos, como el xilol, que eliminará la parafina, y posteriormente, alcoholes en graduación descendente (100% → 96% → 70%) hasta llegar al agua destilada o tampón, para rehidratar el tejido.

Digestión Enzimática

Durante la fijación en formol de los tejidos FFPE, se producen ciertos enlaces entre las proteínas y otras macromoléculas. Para liberar los ácidos nucleicos de las uniones a proteínas (histonas y otras), y así permitir que puedan hibridar con la sonda, y para permeabilizar la muestra, se realiza una digestión enzimática. Las enzimas más utilizadas son:

Proteinasa K
Pepsina

Prehibridación

Con los lavados de prehibridación, utilizando una solución que contiene ADN de esperma de salmón fragmentado, se bloquean las posibles uniones inespecíficas de las sondas al tejido.

Hibridación

Se inunda el portaobjetos con la solución de hibridación. Tras ello, se realiza la desnaturalización tanto de la sonda como de la secuencia diana. Para ello, se depositan aproximadamente 5 µl de sonda sobre el tejido y se coloca un cubreobjetos encima, evitando la formación de burbujas. Una vez colocada la sonda, se sitúa el portaobjetos en una placa calefactora a 95 °C durante 5-10 minutos. Este tiempo debe ser suficiente para desnaturalizar ambos ácidos nucleicos, pero no tanto como para que se seque o se produzcan burbujas sobre la muestra. A continuación, se introduce el portaobjetos en una cámara húmeda para evitar la desecación de la sonda.

Lavado de Poshibridación

Tras la hibridación, se lavan los portaobjetos con soluciones de poshibridación, mediante inmersiones en cubetas de Coplin que contienen dichas soluciones, durante los tiempos y temperaturas establecidos por los fabricantes de las sondas. Con ello, se intenta aumentar la rigurosidad para conservar solo los híbridos formados entre la sonda y la secuencia diana.

Detección del Híbrido

Las sondas que se utilizan en las técnicas de CISH se marcan con haptenos. Para detectarlas, se emplean métodos inmunohistoquímicos indirectos amplificadores de señal. De esta forma, se obtiene un producto coloreado que se deposita en el tejido alrededor del híbrido. La sensibilidad de esta técnica dependerá del método utilizado en la detección. Se elegirá un método u otro dependiendo del marcador a utilizar y del tamaño de la sonda.

Contratinción

Para poder observar el resto del tejido y no solo la muestra, se utiliza la contratinción. Se emplea una tinción suave que no enmascare el resultado de la CISH, pero que permita analizar el resultado en su contexto, es decir, en qué tejido y en qué células de ese tejido se encuentra nuestro híbrido.

Visualización

Las preparaciones se visualizan con un microscopio óptico de luz transmitida. Dependiendo de las secuencias a detectar, la reacción coloreada se encontrará en el núcleo o en el citoplasma.