Protocolo Detallado de Micropropagación Vegetal: De Semilla a Plántula en Invernadero

Protocolo Experimental de Micropropagación Vegetal

A continuación, se detallan los procedimientos seguidos en las distintas fases de la micropropagación vegetal, desde la selección del material inicial hasta la aclimatación en condiciones ex vitro.

1. Selección y Preparación del Explante Inicial

Se emplearon las semillas como explante inicial para la primera fase de propagación en medio basal, hasta obtener plántulas con una altura de 3 a 6 cm.

2. Procedimiento de Desinfección y Fases de Micropropagación

Fase I: Desinfección y Germinación

El proceso de desinfección del explante (semillas) se realizó siguiendo los siguientes pasos:

• Lavado inicial: Tres lavados de 10 minutos cada uno con detergente líquido al 1% en agua corriente.
• Tratamiento con etanol: Lavado posterior con etanol al 70% durante 45 segundos.
• Blanqueo: Sumergión por 25 minutos en una solución de blanqueador comercial al 15%.
• Enjuague final: Cuatro enjuagues con agua destilada estéril bajo condiciones de asepsia estricta.

Posteriormente, las semillas desinfectadas se inocularon en el medio de cultivo basal.

Medio de Cultivo de la Fase I

Los cultivos se establecieron en medio basal MS (Murashige y Skoog, 1962), ajustado a un pH de 5.7 y suplementado con 8 g L⁻¹ de agar como agente gelificante.

Condiciones de Incubación

Los cultivos se mantuvieron a una temperatura de 25 ± 2 ºC bajo luz continua (54 µmol m⁻² s⁻¹) durante 30 a 45 días, hasta alcanzar el tamaño deseado para la siguiente etapa (3 a 6 cm de altura).

Fase II: Multiplicación de Brotes

Para esta fase, se tomaron explantes de tejidos meristemáticos. Estos se inocularon en medio basal suplementado con diversos tipos y concentraciones de citocininas. El objetivo fue determinar el tratamiento hormonal más eficiente para estimular la generación de brotes múltiples en los explantes.

Los cultivos se mantuvieron bajo estas condiciones, y a los 90 días se registró el número de brotes generados por cada explante.

Fase III: Enraizamiento

Los brotes generados en los medios de multiplicación (que contenían citocininas) se separaron del explante original y se transfirieron a medio basal sin reguladores de crecimiento.

A los 30 días, se registró el porcentaje de brotes que lograron desarrollar raíces.

Fase IV: Aclimatación (Ex Vitro)

Los brotes que mostraron enraizamiento exitoso fueron sometidos a un proceso de aclimatación progresiva a las condiciones ambientales externas:

1. Se eliminó el sello y se aflojó la tapa de los recipientes para iniciar la adaptación gradual a la humedad del medio externo.
2. Pasados 15 días, los brotes fueron extraídos del medio de cultivo y lavados con agua corriente.
3. Se sembraron en una mezcla de sustrato compuesta por tierra para macetas y arena en una proporción 1:1.
4. Finalmente, las plántulas se trasladaron al invernadero.

La supervivencia se evaluó entre los 30 y 45 días posteriores al trasplante, concluyendo que la adaptación al suelo fue satisfactoria.

3. Resumen de Medios de Cultivo Empleados

Se utilizaron diferentes sustratos según la etapa del proceso:

• Propagación y Multiplicación (Fases I y II): Medio basal MS (Murashige y Skoog, 1962) con agar (8 g L⁻¹).
• Enraizamiento (Fase III): Medio basal MS sin reguladores de crecimiento.
• Siembra en Invernadero (Fase IV): Mezcla de tierra para maceta y arena en proporción 1:1.