Protocolo

^{centrifugacion-evitar la exposición de muestras a la luz, ya que muchas propiedades son fotosensibles a la luz
artificial y a la del sol (ultravioletas) en cualquier periodo de tiempo. Estas muestras tienen que estar protegidas con papel de aluminio o similar.} 

^{Centrifugación previa al traslado: En el supuesto de que en el módulo de obtención de muestras se realice la separación por centrifugación, es preciso que se tengan en cuenta estas recomendaciones:}

• ^{Suero. La sangre tiene que estar coagulada antes de la centrifugación. Para acelerar el proceso hay tubos que contienen un activador, trombina (5 minutos) o partículas de sílice (15 minutos). Hay que agitar el tubo.}
•  ^{Plasma. Las muestras que requieren plasma pueden centrifugarse a los pocos minutos de su obtención.
  Se recomienda la utilización de barreras separadoras. En este caso, no es necesario separar el suero o plasma obtenido por centrifugación.}

^{Ventajas de la utilización del tubo primario:}

^{• un menor riesgo de contaminación del personal del laboratorio al ser menor la manipulación de la muestra,}

 ^{• menos errores de identificación de muestras}

^{• mayor rapidez en el procesamiento de las muestras}

^Pasos:

^{1. Mantener la sangre en el recipiente original tapado .}

^{2. Se selecciona la temperatura de centrifugación al igual que el tiempo y las g normalmente 18 -22 ºC .}

^{3. Algunos componentes necesitan refrigeración.}

^{Postcentrifugación}

^{Asegurarnos de la calidad del suero o plasma: Libres de hematíes, fibrina, plaquetas, etc.}

^{Alicuotado y etiquetado de estas alícuotas.}

^{Reparto de los tubos a las diferentes secciones.}

^{Mantener los tubos tapados hasta el momento de introducir al autoanalizador.}

^{Comprobar el etiquetado de los tubos y las listas de trabajo de cada analizador. Ordenar los tubos primarios en gradillas siguiendo el orden del listado obtenido Trabajar siempre que sea posible con tubo primario}

^{Si el análisis no se va a efectuar de inmediato hay que separar la muestra del sistema de barrera y estabilizarla, si lo requiere, antes de proceder a su refrigeración o congelación.} 

^_seroteca

_{Muestra no etiquetada o etiquetada de forma que puede llevar a confusión Transporte inadecuado}

_{Tiempo excesivo desde la obtención de la muestra
Contenedor inadecuado}

_{Contenedor no estéril}

_{Contenedor roto o muestra derramada
Contaminación exógena obvia}

_{Muestras duplicadas tomadas a la vez (Excepto para hemoclutivos)
Muestras no adecuadas para la petición realizada}

_{Cantidad insuficiente para el estudio solicitado}

_{Toda muestra biológica previamente manipulada, o en caso de suero, cuando no sea tubo primario.}

_{OBTENCIÓN DE LAS DIFERENTES MUESTRA SANGUINEAS}

_{SUERO: Es sangre desprovista de células y factores de coagulación, rica en componentes celulares y productos metabólicos sobre todo de plaquetas.}

_Obtención

• _{A partir de sangre por centrifugación después de finalizado el proceso de coagulación. Se produce a mayor velocidad si el proceso se realiza a
  37°C. Para ello colocaremos un tubo conteniendo la sangre sin anticoagulante, en un baño termostato.} 
•  _{La sangre se mantiene en el tubo primario. Hay que dejar el tiempo suficiente a fin de evitar la formación de fibrina.}

_{Tubo - Examen}

_{Tubos secos no siliconados}

_{Tubos secos siliconados} 

 _{Tubos con gel Usos: Bioquímica general   - Inmunohematologia    - Medicina nuclear   - Hormonas}

_{-Marcadores tumorales - Inmunologia}

_{Tubos con trombina}

_{Tubos con trombina y gel, BD Vacutainer® RST}

_Precauciones

_{No refrigerar antes de la centrifugación (alteración de la bomba sodio-potasio y aumento de los volúmenes de la muestra
Si tras esta centrifugación no se ha separado bien el coágulo del suero, se puede volver a centrifugar pero existe      peligro de hemólisis. No recentrifugar en el caso de usar tubos con barrera de gel.}

_{Para acelerar la obtención de suero se puede desfibrinar la sangre con gránulos o varillas de cristal.
Hay que evitar el contacto prolongado del suero con el coágulo, para reducir los efectos metabólicos de las células sanguíneas.
Si se pretende obtener suero a partir de sangre de enfermos heparinizados, esta se coagula añadiendo 0 , 2 ml de Reptilase por cada 2ml de sangre total.}

_{Conservación: Refrigerados a 4-6 ºC hasta su análisis .Congelados a -20 ºC si no se analiza en el día}

_{PLASMA: Es sangre desprovista de células con factores de coagulación.}

_{Obtención: A partir de sangre por centrifugación habiéndose inhibido el proceso de coagulación. Centrifugar antes de transcurrida 1 hora desde la obtención de la muestra, en tubo primario.} 

_{Tubo utilizado}

_{o Tubos con heparina -Amonio}

_{o Tubos con heparina y gel PST™ II}

_{o Tubos para pruebas de glucosa}

_{o Tubos con citrato -Coagulación - Control anticoagulación}

 _{o Tubos con EDTA  -Hemostasia basal  -Hemograma y formula  -Banco   -Hemoglobina glicosilada}

  _{- BNP (t.  plástico) (péptido natriurético marcador de la insuficiencia cardiaca descompensada)}

   _{-Bioquímica  urgente}

_{o Tubos con fluoruro -Lactato}

_{Aplicaciones Si queremos plasma libre de plaquetas (PLP), es necesario una centrifugación a más velocidad y durante un tiempo mayor.  Tras la centrifugación, el sobrenadante PLP se retira, rápidamente del resto y se transfiere a un tubo adecuado. Suele ser el utilizado en la mayoría de las pruebas de coagulación}

_{El PRP (Plasma Rico en Plaquetas) se logra mediante una centrifugación suave (1000 rpm) de la muestra durante 10 minutos. Tras la centrifugación, el sobrenadante se retira rápidamente de la muestra y se transfiere a un tubo adecuado. Se suele emplear para estudios plaquetarios.  Al igual que en el suero, tras la centrifugación, separaremos el plasma de los elementos formes sanguíneos para evitar efectos metabólicos. En caso de no utilizarlo inmediatamente, lo conservaremos como en el caso del suero.}

_{ES IMPRESCINDIBLE EL CONTROL VISUAL DEL PLASMA DESPUÉS
          DE LA CENTRIFUGACIÓN A} DIVERSAS VELOCIDADES .

_{FRACCIONES SANGUINEAS}

                         _.                         

<sub>- Se ha de realizar por la mañana (8:00 a.m.) después de 10 a 12 horas de ayunas, medicación, sin café.
- Tras preparación durante los tres días anteriores con dieta no restrictiva en hidratos, con actividad física normal y sin estrés. - No debe realizarse en el curso de una enfermedad aguda.</sub>

_{- Durante la prueba, el paciente debe permanecer en reposo relativo, sin fumar y sin ingerir alimentos ni bebidas.}

_{En la realización de la prueba:}

_{1° - Extracción de sangre en tubo con gel separador para determinar la glucemia plasmática venosa BASAL.}

_{2° - Administración de la Sobrecarga Oral de Glucosa mediante la toma de glucosa en 5 a lO min.:
      - Adultos: 75 g. de glucosa. (Gluconaranja 75g/250ml)}

_{- Embarazadas (confirmación del Test de O'Sullivan): 100 g de glucosa (Gluconaranja 100g/250 mL) - Niños: 1,75 g de glucosa por Kg de peso ideal (pero sin pasar de 75 g)}

_{3° - Realizar la extracción de sangre en tubo con gel separador para determinar la glucemia plasmática venosa:
  - Embarazadas (confirmación del test de O'Sullivan): a los 60, 120 y 180 min. del último sorbo de glucosa.
  - Adultos: a los 120 minutos del último sorbo de glucosa}

_{- Niños: a los 30, 60, 90 y 120 min., del último sorbo de glucosa.}

_{Determinación  MTF: drogas terapéuticas : la monotorizacion terapeutica de farmacos garantiza que un paciente este recibiendo la dosis adecuada de un teterminado farmaco} 

_{Muestra requerida  Contenedor empleado:Plasma o suero son las muestras más habituales,Edta es el anticoagulante óptimo, Puede hacerse en orina, saliva, LCR, etcEtiquetado correcto, Anotar en el lugar correspondiente el momento exacto en que se tomaron las  muestras, algunos contaminantes liberados desde los recipientes de plastico o vidrio pueden afectar a los resultados de las pruebas.}

_{Precauciones: el volante de solicitud esta debidamente rellenado, con los datos  de la dosis , forma farmaceutica via de administracion, asi como hora de la ultima dosis administrada. puede requerirse conocer la farmacocinetica del farmaco para realizar la correcta toma en el momento adecuado}

_{Procesamiento:tranporte inmediato. evitar hemolisis.}

_{intervalos toma muestra de sangre: terapia largo plazo→ basica/ siempre o estado estacionario}

_{administracion intravenosa:esperara hasta que se complete la fase de distribucion}

_{excepciones: digoxina 6-8 digitoxina 6-8}

_{determinacion de lipidos: muestra requerida suero,}

_{precauciones: la congelacion y descongelacion requiere homogenizacion previa de la determinacion, la congelacion afecta a los niveles de lipoproteinas  y LDL colesterol.}

_{procesamiento transporte- almacenamiento:conservar hasta una semana refrigerado, para colesterol total y trigliceridos  para periodos mas largos congelar a 20 grados}

_{determinacion de enzimas:la mayoria de enximas son estables a temperatura de refrigeracion hasta 1 semana y a temperatura ambiente durante un tiempo mas breve}

_{fosfatasa acida:inestable a cualquier temperatura a menos que el Ph del suero se reduzca a un valor de 5 o 6 con citrato  o acetato.}

_{fosfatasa alcalina:presenta aumento lineal de la actividad que depende de la temperatura y del tiempo}

_{ALAT Y ADOLASA: no toleran bien la descongelacion por que son inestables si la muestra se congela a -20ºc}

_{amilasa: ha determinar en suero  o plasma, siempre que el anticoagulante usado no sea quelante de los iones calcio, debido a que la amilasa requiere este ion para ejercer su actividad}

_{estudio isoenzimatico: la temperatura de conservacion dependera de la isoenzima a determinar}

_{determinacion hormonas: muestra requerida contenedor empleado: suero o plasma tubo con EDTA y aprotinina para estabilizar las hormonas polipeptidicas labiles y enzimas.}

_{precauciones: diversas hormonas se liberan en pulsos por lo que es necesario tomar varias muestras de sangre  en intervalos de tiempo pequeños y estimar la mediana de las concentraciones.}

_{procesamiento y transporte-almacen: conservacion refrigeracion 2 dias para periodos mas largos congelar a -20ºc, algunas hormonas requieren transporte en hielo y otras a temperatura ambiente, las muestras de pruebas funcionales se centrifugaran lo antes posible, NO se recomienda procesamiento de rutina.}

_{test de tolerancia a la glucosa: paciente en condiciones basales "ayunas" se pone a prueba el sistema endocrino. en el etiquetado se especifica la hora de recogida de la muestra debe anotarse la hora de administracion dela glucosa. la dosis a administrar es 1g de glucosa/kg de peso, debe tomarse en 5 minutos,nos aseguraremos de que se haya ingerido la dosis prevista.}

_{pruebas hormonales funsionales mas frecuentes en lab de endocrinologia: test TRH a cuantificar TSH}

_{test de bloque con metirapona a cuantificar ACTH Y CORTISOL. test hipoglucemia insulinica  a cuantificar PRL,GH,CORTISOL Y GLUCEMIA. test ACTH: cortisol. test tolerancia a la glucosa determinar GLUCOSA. test LHRH}

_{cuantificar LH,FSH}

_{crioaglutinina: A.C que reaccionan con el frio. no hay precipitacion en 8 dias grioglobulinemia negativa.}

_{determinacion  hemocultivo: la deteccion de la bacteriemia y la fungemia es prioritario en lab de micro, dada su importancia diagnostica y pronostica, se asocia con elevada mortalidad entre 20 y 50%}

_{muestra contenedor empleado: sangre entera, botella comercial con medio aerobio o anaerobio presion negativa.}

_{precauciones:extracion totalmente esteril.}

_{procesamiento trans-almacen: remitir lo antes posible al LAB para iniciar cuanto antes su cultivo en estufa.}

_{bacteremia y fungemia: complicaciones graves de infecc bacterianas y fungicas, tienen metodologia diagnostica similar. se producen cuando los microorganismos invaden el torrente sanguineo y se multiplican a un ritmo que supera la capacidad del SRE para eliminarlos}

_{muestra contenedor: frascos hemocultivo llevan anticoagulante la mayoria SPS (polianetol sulfonato sodico) concentracion de  0,006 al 0,050%, inhibe actividad bactericida del suero humano. se utilizan 2 botellas de hemocultivo por cada toma una para aerobios y otra para anaerobios}

_{precauciones:evitar coagulacion para que los germenes queden atrapados en el interior, NO se aconseja extraer sangre de derivaciones o cateteres salvo que se quiera investigar una posible infeccion)}

_{procesamiento trans-almac: los frascos se observan diariamente pata detectar signos visibles de crecimiento bacteriano como el enturbamiento del medio, la hemolisis, la produccion de gas o la formacion de colonias en el fondo del frasco}

_{sepsis y septisemia: se emplea para denominar sindrome clinico que manifiestan bacterias y hongos}

_{Momento y lugar de la extracción.- Se extraerán 2-3 hemocultivos con el menor intervalo de tiempo posible después de la aparición de los síntomas utilizando lugares de venopunción diferentes. Cada hemocultivo o extracción consta de dos frascos con tapones de diferente color.
Contienen diferentes medios de cultivo ( caldo triptosa, infusión cerebro-corazón,…) y un anticoagulante (SPS o polianetol sultonato sódico).
Método de la extracción:
Después de la palpación de la vena elegida para la punción se limpiará la zona con alcohol isopropílico o etílico de 70º durante 30 segundos. Se aplicará a continuación una solución yodada (tintura de yodo al 1-2% durante 30 segundos o povidona yodada al 10% durante 1minuto) cubriendo un área circular de 2-4 cm de diámetro. Es importante dejar secar el compuesto yodado para que ejerza su acción oxidante y evitar tocar con los dedos el lugar de la venopunción, así como hablar o toser mientras se realiza la extracción. En pacientes alérgicos a los compuestos yodados se deben realizar dos limpiezas con alcohol isopropílico.
1- Levantar la lengüeta plástica de los frascos y limpiar los tapones con una gasa impregnada en solución yodada o povidona yodada.
2- Colocar el compresor al paciente tras elegir la vena a pinchar. Tras ello se limpia con una gasa impregnada en alcohol de 70° una zona de la piel de un diámetro de 3-5 cm en el lugar elegido para la palpación y los dedos del explorador. Dejar actuar al menos 1 minuto.
3- Pintar ampliamente con povidona la piel de la zona a pinchar (al menos en un diámetro de 10cm). A continuación se pintarán las yemas de los dedos índice, medio y pulgar de la mano utilizada para la palpación de la vena. El efecto de la povidona no se ejerce de modo total hasta que transcurre el tiempo suficiente para su oxidación (secado).
4- Extraer un mínimo de 10 ml de sangre (5 ml por frasco) en los adultos y la mayor cantidad posible en los niños, a ser posible una cantidad mínima de 2 ml (1 ml por frasco).
5- Introducir 5 ml de sangre en cada uno de los dos frascos correspondientes a esa extracción (aerobio y anaerobio), evitando la entrada de aire, pinchando a través del tapón de goma. Nunca se destapará el tapón de goma que viene sellado con una arandela metálica.
Se tendrá la precaución de sujetar bien el émbolo de la jeringa para que la presión del vacío que existe en el frasco no aspire rápidamente más cantidad de sangre que la adecuada ni el aire que pudiera quedar en el fondo de la jeringuilla. Es correcta la utilización del sistema Vacutainer
para la extracción de los hemocultivos, teniendo la precaución de extraer los frascos de hemocultivos antes que cualquier tubo para otros fines, ya que se puede contaminar la aguja del sistema Vacutainer y por consiguiente los hemocultivos extraídos con posterioridad.
6- Se rotulará cada frasco con una etiqueta adhesiva en la que figuren el nº de historia, nombre del enfermo y el número de extracción realizada (1º, 2ª ó 3ª), teniendo la precaución de no tapar la etiqueta de código de barras del frasco.}

_{ENVÍO DE LOS HEMOCULTIVOS AL LABORATORIO
1- Se rellenará un volante para cada extracción (dos frascos). Es absolutamente necesario indicar en los volantes el nombre del paciente, el servicio donde se encuentra ingresado, el número de cama y el número de teléfono del control de enfermería con objeto de informar los
resultados preliminares en caso de positividad. Si los hemocultivos son extraídos en el Servicio de Urgencias y el paciente es dado de alta, se anotará en los volantes el número de teléfono del domicilio del paciente o donde pueda ser localizado en caso de positividad. Sería deseable añadir en los volantes otra información que ayudara a la valoración de la bacteriemia en el laboratorio como si está recibiendo tratamiento antibiótico, la enfermedad de base del paciente, el síndrome clínico que padece en el momento actual y si la infección es de adquisición nosocomial o comunitaria.
2.- Los 4-6 frascos de cada paciente con los 2-3 volantes se introducirán en una bolsa de plástico y se enviarán inmediatamente al Servicio de
Microbiología
RECEPCIÓN Y REGISTRO DE LOS HEMOCULTIVOS
Los técnicos del laboratorio sacarán de la estufa los hemocultivos llegados durante la noche y procederán de la siguiente forma:
1- Sacar los 4-6 frascos y los volantes de la bolsa de plástico y colocarlos por parejas en el orden de extracción (1ª, 2ª y 3ª).
2- Comprobar que cada pareja de frascos llega acompañada de su volante correspondiente y que coinciden los datos que figuran en los volantes y en los frascos.
3- Asignar a cada extracción, bien sea de dos o un solo frasco, un número correlativo del registro general. Dicho número se anotará en el volante y en el frasco o frascos de cada extracción.
4- Si la petición es de cultivo para micobacterias, existe un frasco especial para tal fin. Sólo es necesario un frasco y por tanto una sola extracción.}

<sub>PROCESAMIENTO.
INTRODUCCIÓN DE LOS HEMOCULTIVOS EN EL SISTEMA utilizado por el laboratorio que puede ser:
a. Manual. Comprende a su vez:
1.Convencional
EXTRACCIÓN DE LOS FRASCOS SOSPECHOSOS DE CRECIMIENTO. Basado en la observación diaria macroscópica de los signos de crecimiento. Sólo se detecta a partir de 107 UFC/mL. Se ha de complementar con el examen microscópico. La técnica más utilizada es el Gram.
PROCESAMIENTO DE LOS FRASCOS
En la cabina de seguridad biológica, donde se encuentran todos los frascos que el sistema ha detectado como sospechosos de crecimiento colocados por orden numérico, se introduce en cada uno de los tapones de goma de los frascos una aguja con su jeringa. Tras invertir los frascos con una ligera agitación, se extraen de los mismos 2 ml de caldo que se introducen en un tubo estéril rotulado con el número del frasco. A continuación se realizará la identificación del microorganismo siguiendo una sistemática. (Gram…etc.)
2. Bifásico. Utiliza el frasco de Castañeda con un medio bifásico compuesto de una fase sólida y otra líquida. Al inclinar el frasco el medio líquido cubre el sólido realizando un subcultivo cuantas veces se desee. Mejora la detección de bacterias y hongos y es más rápida.
3. Lisis-filtración. En este método, tras la lisis de las células sanguíneas se procede a filtrar la sangre para retener las bacterias. El filtro o fragmentos del mismo se siembran en distintos medios de cultivo. Este método invierte mucho tiempo y no se usa de rutina.
4. Lisis-centrifugación. (Sistema Isolator) La sangre se mezcla con el contenido del tubo para conseguir la lisis celular. A continuación se centrifuga para separar los elementos sanguíneos de los microorganismos (3000g 30 min). Se desecha el sobrenadante y se siembra el
sedimento en distintos medios de cultivo. Permite recuperar más microorganismos y más rápido. Caro. Detecta levaduras mejor que otro sistema. Se utiliza cada vez más en el diagnóstico de las bacteriemias relacionadas con catéteres intravasculares.
b. Automático
1. Radiométrico y no radiométrico. Fue el primer sistema automático. Utiliza sustratos marcados con C14 que al ser metabolizado por los microorganismos libera CO2 al medio, que difunde a la atmósfera del frasco. Es esta atmósfera se mide periódicamente el nivel de Co2 y se expresa como un índice de crecimiento cuando se compara con frascos de control. El no radiométrico utiliza la espectrometría de infrarrojos para detectar el CO2.
2. Sistemas automáticos de monitorización continua. Son los más ampliamente utilizados. Se basan en la detección del CO2. Los datos se transmiten a un ordenador donde se analizan según sofisticados algoritmos que detectan el crecimiento bacteriano.</sub>

_{TIEMPO DE CULTIVO
La mayoría de los potenciales patógenos responsables de bacteriemia se aísla en los hemocultivos entre las 18 y 72 horas siguientes del inicio de su incubación. Más del 95% de los microorganismos se aíslan durante la primera semana, lo que motiva que se mantenga la incubación durante 7 días.
Existen, no obstante, algunos patógenos y situaciones en los que se precisa más tiempo para su crecimiento como los hongos, microorganismos del género Brucella y algunos microorganismos causantes de endocarditis por lo que, ante la sospecha de cualquiera de estas circunstancias, se
prolonga la incubación hasta 4 semanas. Los frascos se observan diariamente para detectar signos visibles de crecimiento bacteriano como el enturbiamiento del medio, la hemólisis de los hematíes, la producción de gas o la formación de colonias en el fondo del frasco.}

_{RECEPCIÓN Y REGISTRO DE LOS HEMOCULTIVOS
INSPECCIÓN INICIAL
En cuanto se reciben los hemocultivos en el laboratorio, y antes de ser introducidos en los aparatos automáticos, los hemocultivos deben ser examinados cuidadosamente para comprobar que pueden ser manejados con seguridad, que estén íntegros, sin roturas o fisuras, que su identificación es correcta, que el volumen de sangre es adecuado y para detectar macroscópicamente signos de crecimiento. Si éstos últimos no existen, los frascos se introducirán rápidamente en los aparatos automáticos para evitar el retraso en el crecimiento de los microorganismos.
CRITERIOS DE RECHAZO
En general, no se rechazará nunca un hemocultivo dada la importancia del diagnóstico de la bacteriemia, salvo en el caso en que haya serias dudas en cuanto a la identificación de la muestra o los frascos estén dañados y contaminados. En el caso de graves deficiencias en el envío de la muestra se contactará con el servicio que la remite para solucionarlas y después se procesará.
Los hemocultivos aceptados para ser procesados se registrarán en el sistema informático utilizado por el laboratorio.
NORMAS DE SEGURIDAD
Existe un significativo riesgo biológico para el personal sanitario derivado de la extracción, transporte, manejo y eliminación de los hemocultivos, sobre todo por la manipulación de las agujas. El personal por lo tanto deberá seguir de manera estricta las normas contenidas en el Manual de Seguridad del laboratorio de Microbiología}

_{determinacion  Estudio básico decoagulación INCLUYE tiempo deprotrombina, tiempo de
tromboplastina parcial activada ó TTPA, fibrinógeno, recuento de plaquetas.
Muestra requerida Contenedor empleado: Se requiere un tubo azul y otro lila no humedecibles provistos de vacío. El citrato (3,8%) es el anticoagulante estándar para pruebas de coagulación. Para recuento de plaquetas se utilizará Edta K3.
-Tubos de vidrio con citrato: citrato trisódico tamponado
-Tubos con CTAD: mezcla de varios aditivos, ideales para la monitorización de la terapia con
heparina Invertir el tubo suavemente.}

_{Precauciones: Interferencias por:}

<sub>1. Muestra hemolizada
2. Muestra ictérica
3. Algunos factores de la coagulación son activados por el frío y hay que evitar la refrigeración (factores VII, XI y XII) El daño causado a los tejidos ha de ser mínimo (torniquete). Menor éstasis circulatorio posible. Por eso de desechan los primeros mL de sangre cuando no hay
varios tubos e insertar posteriormente este tubo en extracciones múltiples.</sub>

_{Procesamiento Transporte.-Almacenamiento:  Mantener en un baño de hielo. Realizar antes de 6 horas (en el dia) Si hay que realizar estudios posteriores, las muestras se congelarán a -20 ºC como
mínimo, haciendo la congelación rápida (hasta 4 semanas). La congelación más intensa
permite el almacenamiento hasta 6 meses.}

_{La coagulación sanguínea juega un papel crucial en la hemostasia aunque solamente se produce mediante la interacción de numerosos factores. El cuerpo humano, mediante un complejo mecanismo que hace que la sangre se coagule al producirse una herida, por una parte se protege de una excesiva pérdida de sangre y por otra, de una coagulación excesiva Para controlar el tratamiento anticoagulante pueden utilizarse tanto sangre venosa como sangre capilar. Para realizar una lectura se añade tromboplastina a la sangre con el fin de activar la coagulación. Esto provoca que se forme un coágulo de sangre. El tiempo que tarda en formarse el coágulo se mide en segundos y se conoce como tiempo de protrombina (TP). En algunos países europeos, la coagulabilidad sanguínea se expresaba generalmente en una unidad denominada valor Quick. En este caso, el tiempo de protrombina medido se expresa en relación con el tiempo de coagulación de una persona sana. El valor obtenido es el porcentaje del valor estándar. En una persona que no recibe tratamiento con anticoagulantes orales, el valor Quick normal se sitúa entre el 80% y el
120%. Un valor Quick de solamente un 30%, por ejemplo, indica que el tiempo de coagulación sanguínea es más prolongado de lo normal. Cuanto más prolongado es el tiempo de coagulación del paciente, más bajo es el valor Quick.}

_{CONTROL DE TRATAMIENTO ANTICOAGULANTE ORAL (TAO)
El tratamiento anticoagulante precisa de un cuidadoso control analítico.
La dosis-respuesta está influenciada por múltiples factores y existe una gran variabilidad individual:}

• _{Inconstante aporte de Vit K en la dieta}
• _{Cambio en la medicación}
• _{Variable unión a proteínas plasmáticas}

_{Indicaciones del tratamiento con anticoagulantes:
Profilaxis primaria y secundaria de la ETV (no se usan en las trombosis agudas ya que no tienen acción inmediata sobre la fibrina formada).}

_{Fármacos principales empleados en la profilaxis y tratamiento farmacológico de la TVP: Profilaxis: Heparina, Sintrom ( a largo plazo).}

_{Tratamiento: Heparina
Anticoagulantes orales: Sintrom (Acenocumarol) Aldocumar (Warfarina)
Mecanismo de acción: Los factores de la coagulación (II, V, VII, IX, X) se sintetizan en el hígado, por acción de la vitamina K. Los anticoagulantes son antagonistas de la Vitamina K.
Interaciones farmacológicas con los anticoagulantes orales: Potenciadores de los anticoagulantes orales: Ac. Acetilsalicílico, Ciprofloxacilo, Fenilbutazona, Indometacina, Fibratos, Antiserotoninérgicos, Cimetidina, Omeprazol, Neomicina, Colimicina, Tetraciclina, Cloranfenicol.
Inhibidores de los anticoagulantes orales: Vitamina K, Hipnóticos y Barbitúricos, Rifampicina, Fenobarbital. De toda la lista de fármacos con poder anticoagulante o coagulante unos actúan a nivel intestinal, otros a nivel plasmático y otros a nivel hepático.
Índice de sensibilidad internacional (ISI)
Los valores Quick medidos con distintas tromboplastinas no pueden compararse directamente unos con otros. Para hacer que los tiempos de coagulación fueran lo más comparables posible, la Organización Mundial de la Salud (OMS) aprobó en 1983 una tromboplastina estándar. Todos los fabricantes de tromboplastina deben calibrarla frente al estándar de la OMS (existen 2 referencias: una para tromboplastinas recombinantes humanas y otra para tromboplastinas de cerebro de conejo). El valor obtenido se conoce como índice de sensibilidad internacional (ISI). Esto permite conocer las distintas sensibilidades de las tromboplastinas.
Índice normalizado internacional (INR) Dado que el valor Quick/TP depende en gran medida del país y del laboratorio, en la actualidad el valor que normalmente se mide es el valor INR. Es la unidad recomendada a nivel mundial para medir el tiempo de tromboplastina. El INR hace que las medidas de la coagulación sean ampliamente comparables a pesar de la cantidad de tromboplastinas distintas que se utilizan.
INR = (TP del paciente / TP medio normal) ISI
Por ejemplo: el TP de un paciente que recibe tratamiento con anticoagulantes orales es de 64 segundos (= 18% Quick). El tiempo de protrombina de un plasma normal es de 22 segundos (= 100% Quick). El ISI de la tromboplastina utilizada es 0,93. Sustituyendo este valor en la fórmula expuesta más arriba se obtiene el siguiente INR:
(64) / (22) 0,93 = 2,7 INR Esto significa un tiempo de coagulación que es 2,7 veces más prolongado que el estándar. Cuanto más prolongado es el tiempo de coagulación del
paciente, más elevado es el INR. Al principio es necesario realizar controles frecuentes, ya que según el paciente el ajuste requiere cierto tiempo.}

_{Determinación  Extensiones de sangre}

_{Muestra requerida Contenedor empleado:}

_{Sangre periférica:
Capilar,
Venosa anticoagulada con Edta
Central:
Punción aspirativa de la M.o.
Biopsia ósea sobre cresta iliaca Se emplean portas y cubreobjetos.
Procesamiento Transporte.-Almacenamiento:  Han de analizarse antes de 2 horas (transcurridas estas aumentan sobre todo los cayados)}

_{determinacion  Hematimetría básica.}

_{Muestra requerida Contenedor empleado:}

_{Procesamiento Transporte.-Almacenamiento:  No demorar más de 24 horas. Homogeneizar bien la muestra mediante agitadores rotativos. Desechar las muestras que presentan microcoágulos.}

<sub>Determinación Banco de sangre
EXTRACCIÓN: Se extraen 400-450 mL en un tiempo menor de 7 min. para evitar la puesta en marcha de los mecanismos de la coagulación. Como norma general la volemia de una persona es de 80 cc por Kg de peso. Así una persona de 10 Kg de peso tiene 800 cc de sangre.
Nunca superar la extracción de 8 cc por kg de peso En nuestro país se estandariza el volumen a extraer en 400-500 cc pues entra dentro de los  márgenes para el peso de la mayoría de la población. El recipiente ya tiene la relación de anticoagulante adecuada a este volumen.
En los casos de autotransfusión se utiliza la fórmula: Vol. extraído = Kg del donante x 450 mL / 50
y se adecua el anticoagulante de la bolsa. Según la Legislación actual se pueden realizar 3
extracciones por año en la mujer, como máximo, y 4 en el varón.
Datos que han de constar en el volante de petición:
1. Identificación inequívoca del paciente
2. Identificación del médico solicitante y su firma
3. Identificación de la persona que extrae la muestra para su estudio y su firma
4. Producto y cantidad solicitados
5. Datos que justifican la trasfusión, completos según el hemoderivado solicitado:
a. Plasma: Indice de Quick, Fibrinógeno
b. Hematíes: Hemoglobina y/o hematocrito
c. Plaquetas: Plaquetas</sub>

_{Muestra requerida Contenedor empleado: Tubo rojo y lila para determinación de grupos.
Para la determinación completa del grupo sanguíneo es indispensable la determinación simultánea de las pruebas globular y sérica. Si existe discordancia entre ellas, no se puede
validar sin la consulta al hematólog/a. El suero se utiliza para exámenes inmunohematológicos (serologia, tubo amarillo)  No permitidas muestras bemolizadas Los componentes sanguíneos se
preparan a partir de sangre total por medio de grandes centrífugas refrigeradas. Las elevadas fuerzas gravitatorias generadas por estos aparatos dan lugar a que la sangre se separe en plasma líquido y sus diferentes elementos celulares. Se presta especial cuidado al equilibrado de las centrífugas para evitar daños a la sangre. El Centro de Trasfusiones dispone de unos complejos sistemas de bolsas interconectadas con tubos que asegura la perfecta y estéril separación de los diferentes componentes con la mínima manipulación: Plasma, Concentrados de hematíes y Plaquetas. Utiliza tambien maquinaria especialpara tales fines.}

_{Precauciones:  La frecuencia de administración de una transfusión equivocada es de 1:60 000 transfusiones. Por lo tanto hay que asegurarse de la identidad del paciente de una forma activa, preguntándole nombre y apellidos, asignándole un nº al paciente, etiquetando los tubos, rellenando adecuadamente los documentos, etc., según el protocolo establecido  por cada centro.
Aunque no es obligatorio, algunos laboratorios suelen usar unos brazaletes de identificación.
La reacción transfusional puede ser fatal por lo que las muestras para estas pruebas requieren unas condiciones muy estrictas en cuanto a la identificación y el etiquetado.}

_{El donante se somete a unas pruebas: Determinación del grupo
sanguíneo. Determinación de anticuerpos irregulares. Determinación de sífilis. Determinación del VIH (SIDA). Determinación de hepatitis B y C. Determinación de GPT (transaminasas).
El escrutinio de Ac irregulares en el receptor se ha de hacer a menos de 72 horas de la transfusión. Otras pruebas son grupo, Rh. Finalmente se realizan las pruebas cruzadas. Antes de la transfusión hay que revisar la documentación y comprobar el grupo ABO a la cabecera del paciente.}

_{Procesamiento Transporte.-Almacenamiento:  Cada muestra del paciente para examen inmunohematológico debe conservarse entre 4-6 ºC durante la semana siguiente al mismo.
Para la medición de la concentración de aglutininas frías, la muestra de sangre debe guardarse a 37 ºC hasta la separación del suero. Las unidades de sangre tienen que almacenarse en refrigeradores especiales. equipados con un sistema de registro automático de la temperatura y un sistema de
alarma audible y óptico. La activación de la alarma por debajo debería colocarse a 3,5 +- 0,5 ºC y la activación por alto a 5,5 +- 0,5 ºC para los concentrados de hematíes. Así se conservan durante un máximo de 35 días. Las plaquetas se conservan a Tª ambiente y en agitación constante durante 5 días. El plasma se conserva a -40ºC durante 2 años. Cualquier artículo que pueda producir la punción de las unidades de sangre deberá eliminarse de la zona de almacenamiento. La sangre residual de la trasfundida ha de ser guardada entre 2-8 ºC al menos 24 h después de la transfusión.}

_{grupos sanguíneos: son los diversos tipos en que se clasifica la sangre de las personas en relación con la compatibilidad entre las proteínas presentes en la membrana de los glóbulos rojos y las proteínas del plasma.}

_{Aglutinógenos: Proteínas de la membrana plasmática de los glóbulos rojos y que determinan el grupo sanguíneo.
Aglutininas: Proteínas presentes en el plasma sanguíneo.}

_{COMPATIBILIDAD DE GRUPOS
DONANTE Y REXCEPTOR UNIVERSAL}

_{Los elementos fundamentales de la hemovigilancia son:
La Trazabilidad: Se debe poder proceder al seguimiento del donante al paciente receptor de la sangre y viceversa. Desde la extracción hasta su distribución y transfusión. La Notificación de efectos y reacciones adversos graves: todo efecto adverso grave (accidentes y errores) relacionado con la extracción, fraccionamiento, verificación, procesamiento, almacenamiento, distribución y transfusión de la sangre y los componentes sanguíneos, que puedan influir en la calidad y seguridad de los mismos}

<sub>¿Qué son los componentes sanguíneos?
1. Constituyentes terapéuticos de la sangre
2. Que pueden ser preparados por medio de la centrifugación, filtración y congelación.
3. Usando la metodología convencional de un banco de sangre.
Obtención
Donación de sangre total: 400-450 ml.
1 unidad de Concentrado de hematíes (+/- 330 ml.)
1 unidad de plasma (+/- 250 ml.)
1 unidad de plaquetas. (Se sirven en pools de 5 unidades)
Los componentes con células se irradian para reducir el riesgo de enfermedad injerto contra huésped (EICH) en:
- Exanguinotransfusión en recién nacidos
- Receptores de trasplantes
- Inmunodeprimidos
- Niños prematuros</sub>

_{AFÉRESIS = SEPARAR.
Existe una forma especial de donación por la que se obtienen selectivamente unos componentes de la sangre y el resto son devueltos al donante de forma automkática durante el mismo acto de la donación y por la misma vía.} Mediante maquinas llamadas separadoras celulares que procesan un pequeño volumen extracorpóreo se puede obtener el producto deseado en una sola donación HEMATIES: 2/3 Unidades(1 Donante) _{Eritroféresis}
PLASMA: +/- 600 ml (1 Donante) _{Plasmaféresis}
PLAQUETAS: 6 Unidades (1 Donante) <sub>Plaquetoféresis
La técnica estándar comprende las siguientes pruebas de la muestra de sangre del paciente/Receptor:
1. Tipaje correcto del grupo ABO y Rh de D y R. Siempre se intentará transfundir sangre del mismo grupo del receptor y si no es posible se usará una sangre compatible.</sub>

<sub>2. Escrutinio de anticuerpos irregulares en el receptor. A parte de los anticuerpos naturales del sistema ABO existen Ac de otros sistemas. Si se detectan habrá que administrar sangre que carezca de los antígenos correspondientes.
3. Pruebas de compatibilidad o pruebas cruzadas. Estas pruebas se han de realizar en medio salino y en medio albuminoso para detectar todos los Ac presentes.
PREPARADOS SANGUÍNEOS
Los concentrados de plaquetas Son muy demandados a todas las unidades de banco de sangre. Se obtienen por centrifugación de la capa leucoplaquetar. Un pool de plaquetas se obtiene con donaciones de cuatro pacientes. Su conservación en estado funcional óptimo se logra manteniéndolas a Tª controlada de 22 ºC y en agitación constante. Tienen una caducidad de 5 días.
Plasma fresco congelado
Se obtiene al retirar los elementos formes de la sangre y debe ser congelado a -40 ºC antes de las 6 horas siguientes a la donación. Se trata con azul de metileno y posteriormente se irradia para inactivar los microorganismos que presumiblemente estén presentes. Caducidad dos años.
Sangre total
La sangre total es un producto en el que permanecen todos los eritrocitos y la mayor parte del plasma de la unidad original. El período de conservación, a Tª de 1-6 oC, es de 21 días para las extraídas con ACD (ácido, citrato, dextrosa) o CPD (ACD más amortiguador de fosfato inorgánico) y 35 días para las unidades extraídas con anticoagulante CPDA-1 (CPD más adenina). El efecto total de trasfundir una unidad de sangre total a un adulto es elevar el hematocrito alrededor del 1,5%.
Es preferible la utilización de concentrados de hematíes más plasma a sangre total.
Concentrados de hematíes
Es uno de los derivados más empleados. Caducidad 35 días a Tª de 4ºC. La ventaja de su utilización es que disminuye el riesgo de reacciones adversas en el receptor.
Otros derivados Crioprecipitado
Es un producto de muy poco volumen, 10-20 ml, obtenido a partir de la congelación rápida y la posterior descongelación lenta del plasma. Contiene todas las proteínas plasmáticas que precipitan por la acción del frío (fibrinógeno, factor VIII). Se conserva congelado durante un año. Su empleo está indicado en las carencias de fibrinógeno, factor VIII y factor Willebrand, que son tres factores importantes para la coagulación .
Albúmina
Es la proteína que más abunda en el plasma. Su participación es fundamental en el mantenimiento del volumen sanguíneo. Se administra en el tratamiento del "shock" cuando éste se debe a una pérdida masiva de líquido, y en las enfermedades que comportan déficits graves de proteínas
(insuficiencia hepática, alguna enfermedad renal o del tubo digestivo o quemaduras muy extensas).
Anticuerpos y globulinas
Son proteínas encargadas de reaccionar frente a sustancias extrañas al organismo, tanto si son perjudiciales (bacterias, virus, etc.), como si son potencialmente beneficiosas (tejidos y órganos transplantados). Las gammaglobulinas son de suma importancia en la prevención y tratamiento de
numerosas enfermedades infecciosas (tétanos, hepatitis B, varicela, difteria, etc.). La administración de gammaglobulinas inespecíficas se emplea en las inmunodeficiencias congénitas o adquiridas y en el tratamiento de algunas enfermedades autoinmunes.</sub>

_{Determinación Biología molecular: Las técnicas de biología molecular están indicadas para la detección de microorganismos que no pueden cultivarse in vitro o para aquellos de lento crecimiento, con importantes requerimientos nutricionales o de difícil cultivo, en cuyo caso los métodos moleculares mejoran la rapidez, la sensibilidad y especificidad del diagnóstico etiológico}

_{Muestra requerida Contenedor empleado:}  Las muestras de L.C.R., biopsias, orina, muestras respiratorias,… se obtendrán siguiendo los procedimientos indicados correspondientes mientras que las indicaciones de _{las muestras de sangre difieren para cada organismo implicado:
-Plasma para carga viral de VIH, VHC,VHB,CMV,
-Linfocitos para PCR de VIH
-Leucocitos para bacterias y virus intracelulares
-Suero para carga viral de VHC, VHB, PCR de VHC, VHB, Genotipado de VHC
-El material de plástico estéril desechable se considera exento de ribonucleasa y aptos para recogida y transporte.
-Tubos con CPT™ para la separación celular: permiten en un solo paso separación y transporte}

_{Contienen un anticoagulante, gel y Ficoll.
-Tubos PPT™ para la separación celular: útiles para la obtención de plasma estandarizado para
pruebas de diagnóstico molecular (carga viral, PCR, pruebas de ácidos nucleicos).
-Tubos PAXgene™ Blood RNA System: permiten la estabilización y purificación del RNA intracelular.
-Tubos BD™ P100: permite la estabilización de las proteínas en el momento de la extracción.
-Tubos BD™ P700: permite la protección y estabilización de la GLP-1
Técnica Precauciones: Es aconsejable obtener y procesar las muestras para biología molecular con las mismas precauciones de esterilidad que para las técnicas de cultivo. PARA LA OBTENCIÓN DE SUERO Extraer la sangre de un tubo seco de 10 mL con gel separador siguiendo los pasos
indicados para serología infecciosa (Tapón amarillo) PARA DE OBTENCIÓN DE PLASMA, LEUCOCITOS O LINFOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA Extraer la sangre de un tubo de 10 mL con EDTA y gel separador (PPT) Mezclar invirtiendo el tubo de 10 a 15 veces.}

<sub>La separación del plasma, linfocitos y leucocitos debe realizarse antes de las 6 horas de obtener la muestra para evitar su hemólisis
-La heparina retrasa o inhibe la amplificación del DNA durante la reacción en cadena de la polimerasa. No debe usarse como anticoagulante en estos procedimientos.
-Es esencial eliminar la contaminación por eritrocitos cuando se usan procedimientos de ampliación del DNA tales como RCP, ya que la hematina inhibe la enzima DNA polimerasa . Los eritrocitos pueden eliminarse por lisis selectiva con una mezcla tampón de cloruro de amonio, hidrogenocarbonato de potasio y EDTA, a pH 7,4.
-La membrana citoplasmática de todas las células se puede disolver con una mezcla tampón quedando los núcleos de los que puede extraerse el DNA.
Procesamiento Transporte.-Almacenamiento:  Deben mantenerse refrigeradas desde su obtención hasta el laboratorio. Una vez recibidas, en caso de no ser procesadas inmediatamente, serán congeladas. Si se trata de sangre se congelarán tras el fraccionamiento de sus componentes
PROCESAMIENTO EN EL LABORATORIO Tras Centrifugar:
- Con la ayuda de una pipeta de aspiración estéril transferir el suero a un tubo estéril de 1,5 -2mL con tapón de rosca.
- Es conveniente obtener varias alícuotas y congelar si es posible a -70ºC.</sub>

_{No se aconseja conservar la muestra a -20 ºC durante tiempos prolongados, máximo 1 año.
Las muestras estabilizadas pueden se enviadas por correo a la temperatura ambiente. Requieren la adicción de algunas sustancias para evitar la acción de determinados enzimas. Las muestras no estabilizadas deben ser sometidas a congelación súbita (-70ºC) y enviadas en hielo seco. La cadena
de frío no debe ser interrumpida.
-Las muestras han de ser guardadas en soluciones tampón y a determinada temperatura, diferente para RNA y DNA . Centrifugar la muestra en el punto de extracción antes de ser remitida al laboratorio, favorecerá la conservación de la misma.}

_{¿Qué es la carga viral?: Es el nombre que reciben los procedimientos empleados para medir de un modo aproximado la cantidad virus circulante que se encuentra en el plasma o la cuantificación del RNA vírico existente en una muestra (usualmente plasma). Para ello se emplean técnicas de biología molecular, o diagnóstico genético, que tienen su fundamento y origen en la llamada PCR o 'reacción en cadena de la polimerasa' (Polymerase Chain Reaction), desarrollada a mediados de la pasada década, que permite detectar fragmentos del genoma del VIH-1 u otros microorganismos. Las técnicas de carga viral en plasma son más sensibles que el cultivo viral
Indicaciones de estudio de carga viral: Predecir la progresión clínica de la infección por VIH
Monitorizar el tratamiento con antiretroviralesEstimar el riesgo de transmisión, especialmente materno-filial}

_{Determinación  Serología infeciosa:  Los métodos serológicos permiten determinar el estado
inmune del paciente y el diagnóstico de infecciones en aquellos casos en que los microorganismos implicados son de cultivo dificultoso o no cultivables, mediante la detección tanto de antígenos como de anticuerpos microbianos específicos. Detección de Ac IgG e IgM}

_{Muestra requerida Contenedor empleado: Tubo seco de 10 mL con gel separador, sin
anticoagulantes ni conservantes (dependiendo del número de determinaciones solicitadas cada laboratorio establecerá el número de tubos necesario). Tapón amarillo. Procesamiento
Transporte.-Almacenamiento:  Dejar los tubos a temperatura ambiente para favorecer la coagulación hasta su transporte. Transportar las muestras al laboratorio refrigeradas el mismo día de la extracción. En caso de que se produzca una demora en el envío de muestras al laboratorio, éstas pueden conservarse refrigeradas durante 24-48 horas Centrifugar el tubo con la sangre a 1.200 rpm durante 10 minutos. Obtener el listado diario de muestras para serología Para aquellas determinaciones que se vayan a demorar más de 48 horas, se alícuotará el suero y se conservará a -20°C Si es posible se guardará una alícuota para seroteca a -70°C}

_{Determinación  Estudios de cribado serológico sistemático en la embarazada:}

_{Muestra requerida Contenedor empleado:  Se realizan en suero o plasma. El volumen de
muestra necesario y la conservación de la misma, dependerá de las características de las
técnicas a realizar (inmunoensayos convencionales o técnicas de biología molecular). Siempre que sea posible, es conveniente solicitar una cantidad de muestra mayor a la requerida para efectuar las determinaciones solicitadas. Esta consideración está justificada, tanto por la necesidad de posibles repeticiones como por la realización de nuevas determinaciones generadas como consecuencia de los resultados obtenidos.}

_{Técnica Precauciones: Desinfectar la piel con alcohol Dejar secar la piel para evitar la producción de hemólisis en la muestra de sangre Extraer la sangre en un tubo seco de 10 mL con gel separador, sin anticoagulantes ni conservantes (dependiendo del número de determinaciones solicitadas cada laboratorio establecerá el número de tubos necesario) (Tapón amarillo) El modo de realizar la extracción de sangre y su identificación, debe constar en manuales o procedimientos normalizados de trabajo (PNT) realizados por el laboratorio de microbiología y adaptados a las particularidades y características de cada institución.}