Producción de proteínas recombinantes, vacunas y técnicas de detección

Proteínas recombinantes, producción

El vector tiene que tener 1 origen de réplica y un marcador de E. coli, son plásmidos híbridos que tendrán un ori en eucariotas y un marcador seleccionable, también promotor en eucariota, sitio de clonación, ATG y señales de stop transcripcionales y traduccionales, región kozak y secuencia que permite poliadenilación del mensajero. En Saccharomyces (es unicelular, se conoce bien su genética y fisiología, se conocen varios promotores de la levadura y un plásmido natural, lleva a cabo muchas modificaciones post-traduccionales, se ha usado mucho y no requiere tanto estudios). Vectores de levaduras (Yeps basados en plásmidos de 2 micras, más usados, Ylps plásmidos que se integran, Yacs), problema de saco que puede tener baja expresión y producción modesta, puede no secretarse la proteína de interés, produce etanol. Ventajas de Pichia pastoris (tiene un promotor descrito y regulado, en presencia de metanol el 30% de proteínas son alcohol oxidasa y en ausencia no produce proteína, se puede cultivar a altas concentraciones y secreta también pocas proteínas).

DNA fingerprinting

Técnica que detecta diferencias entre individuos de la misma especie. Basada en que en el loci hay unas repeticiones llamadas microsatélites y minisatelites, son repeticiones no codificantes en el loci de los cromosomas que pueden variar entre individuos pero no tienen influencia biológica. Durante la replicación, hay veces que una persona tiene más repeticiones que otra en estos fragmentos. Se puede analizar por enzimas de restricción que separa las cadenas y se hibridan con sondas para obtener un patrón de bandas o mediante PCR, técnica llamada RAPD, en un PCR con un único nucleótido que por azar se pega al ADN en muchos sitios porque por su pequeño tamaño tiene una alta probabilidad de unión.

Métodos de obtención de vacunas

Tradicionales (Vacunas entera inactivada se emplea el agente infeccioso intacto que no puede producir la enfermedad porque se ha tratado con algún agente, vacuna entera atenuada se emplea al agente infeccioso debilitado que produce una afección leve pero con capacidad inmunogénica, vacuna de subunidades tiene algún componente del agente infeccioso, se separa por extracción y separación y se selecciona y purifica el que puede inducir una respuesta inmune protectora). Vacunas antiidiotípicas (la parte del anticuerpo que se une a un determinado epítopo se llama idiotipo, se crean anticuerpo contra el idiotipo dando un anticuerpo parecido al epítopo y así se emplea para vacunar. Son anticuerpos anti-idiotípicos), Vacunas de péptidos sintéticos (basada en síntesis química de péptidos que producen alguno de los epítopos de los antígenos del agente infeccioso, péptidos inoculados y mezclado con sustancias que potencian la respuesta inmune), Vacunas recombinantes vivas (se inserta genes de un agente infeccioso en el genoma de un microorganismos, estos darán proteínas e inducirán una respuesta inmune, Ejemplo Vaccinia que es un poxvirus, su ADN se replica en el citoplasma de la célula infectada). Vacunas de subunidades recombinantes (como el virus del herpes, se identifica los componentes que pueden producir anticuerpos, como la glicoproteína D de la envuelta del virus, se clona el gen y transfecta en células CHO, a la proteína se le quita el dominio transmembrana para que no se quede fija en la membrana y conseguir así que se secreta la proteína, sino costaría trabajo purificarla, al añadirla en el ratón queda inmune). Atenuadas por ingeniería genética (son eficaces, se puede introducir múltiples cambios puntuales que disminuyen la probabilidad de reversión al carácter salvaje, o introducir otro tipo de cambios genéticos como eliminación de un gen o parte de este. Se emplea ingeniería creando un plásmido que contenga una deleción y se introduce en la bacteria para que recombine con su cromosoma). De ácidos nucleicos (se inocula un fragmento de ADN o ARN o un plásmido que codifica al antígeno de interés bajo control de promotor en célula eucariota, cuando esta inoculado el plásmido puede ser copiado y expresado por células con la producción del antígeno para inducir una respuesta inmune.

Microarray

Dispositivo sobre cuya superficie están un gran número de entidades diversas para ser evaluadas a la vez en un único ensayo. De ADN (las entidades son ADN, basados en la expresión diferencial de genes en 1 célula normal y una defectuosa, ambas hibridan diferente. Se extrae ARNm de cada célula y se le hace ADN complementario, se añade un marcador de fluorescencia diferente en cada paciente, disponen en el microarray y analiza el patrón de colores). De proteínas (existen porque estas llevan a cabo funciones celulares, tienen que ser generados uno a uno, se reconoce mal, puede tener reacciones cruzadas con otras proteínas, hay que adherir anticuerpos al soporte, no se cubren todas las proteínas. Los más importantes son los monoclonales, están los de autoantígenos recombinantes para saber si el individuo tiene anticuerpos contra el antígeno que se introduce y anticuerpo monoespecíficos que son anti policlonales diseñados para un conjunto de epítopos específicos de una proteína).

MSP

Técnica que detecta si ciertas citosinas están metiladas mediante PCR. Si se trata la secuencia con disulfuro sódico se convierte la cisteína en uracilo, pero si esta metilada la transformación no se produce. Haciendo PCR, si hay producto es porque las cisteínas no estaban metiladas y viceversa.