Procedimiento de cariotipo en sangre periférica: cultivo, colchicina y extensiones

Cariotipo Estándar en Sangre Periférica

Muestra: Sangre periférica anticoagulada con heparina.

Medio de cultivo: Se utilizan medios como RPMI 1640, DMEM y Ham F10. Estos se suplementan con suero bovino fetal al 10-20%, L-glutamina y antibióticos para evitar la contaminación bacteriana.

Preparación de 100 ml de medio de cultivo:

• 100 ml de RPMI.
• 20 ml de suero bovino.
• 2 ml de antibiótico.
• 1,5 ml de fitohemaglutinina.

Recipiente: Frasco Roux o tubo para cultivo.

Pasos del Procedimiento

1. Siembra: Se añade la sangre heparinizada al medio de cultivo en una proporción de 1/5 a 1/10.
2. Adición de fitohemaglutinina: Este agente actúa como mitógeno para estimular el crecimiento y la división de los leucocitos.
3. Incubación: El cultivo se mantiene a 37 ºC y 5% de CO₂ durante 72 horas. Los tubos de cultivo deben incubarse con una inclinación de 45º en las gradillas. En sistemas de cultivo con CO₂, el tubo debe estar cerrado; en cultivos abiertos de CO₂, se debe dejar el tubo ligeramente desenroscado.
4. Detección de mitosis en metafase: Entre 90 minutos y 2 horas antes de que finalice el periodo de incubación, se añade colchicina. Este compuesto sintético y análogo detiene la mitosis en la etapa de metafase.

Obtención de Extensiones de Metafase

1. Sacrificio del cultivo: El contenido del frasco de cultivo se transvasa a un tubo Falcon cónico de 15 ml y se centrifuga a 1500 rpm durante 5 a 10 minutos. Posteriormente, se elimina el sobrenadante.
2. Choque hipotónico e incubación: Se añaden al tubo 5 ml de cloruro potásico (KCl) 0,075 M (añadido por goteo y precalentado a 37 ºC). Se mezcla el contenido y se incuba entre 5 y 20 minutos a temperatura ambiente o a 37 ºC. Durante este proceso, las células se cargan de agua y se hinchan, permitiendo que los cromosomas se distribuyan por todo el volumen celular y se separen. Al finalizar, se centrifuga a 1500 rpm durante 5-10 minutos y se elimina el sobrenadante.
3. Fijación y lavado: Se utiliza el fijador de Carnoy (una mezcla de metanol y ácido acético), el cual endurece los linfocitos. El fijador, previamente enfriado, se añade gota a gota hasta completar 5 ml. Se deja reposar 5 minutos a temperatura ambiente y se centrifuga a 1500 rpm.
4. Obtención de extensiones por goteo: Utilizando un portaobjetos frío y húmedo, se carga la suspensión celular con una pipeta Pasteur y se dejan caer 1 o 2 gotas desde una distancia de aproximadamente 30 cm. El impacto provoca que las células se rompan y los cromosomas se separen adecuadamente. Finalmente, se deja secar y se procede a teñir (tintar).

Ejemplos de Alteraciones Cromosómicas Comunes

• Síndrome de Patau: 47,XX,+13
• Síndrome de Turner: 45,X
• Síndrome de Klinefelter: 47,XXY
• Cromosoma Philadelphia: 46,XX,t(9;22)(q34;q11.2)
• Síndrome Duplo Y: 47,XYY