PCR: técnica de amplificación de ADN y clonación

PCR: técnica de amplificación de ADN

PCR. Amplificación enz. De un fragmento de ADN. Permite generar millones de copias idénticas de frag. Requieren: Hebra templs, iniciador, dNTPs, DNA polime, cationes. 3 pasos. 1. Desnaturalización del ADN (95°, se separan hebras), 2. Hibridación de dos iniciadores (50°-65°, cebadores se unen a ADN comp y dett fragmento a amplificar). 3. Extensión o elongación de PCR (72°, Taq polimerasa se une al cebador y empieza replicación). PRIMER: Iniciadores o cebador cadena simple 20-40 ns. Long y secuencia dett eficiencia. Enzima Taq Pol: termoestable, capaz de incorporar ns. Desde 3”. De Hot start evitan síntesis a partir de cebadores. MgCl₂: Influye en productividad y especificidad de PCR. Alta cc, produce bajo rendimiento, alta especificidad. Baja cc, produce alto rendimiento, pero baja especificidad. Otros reactivos como DMSO o Betania, amplifican zonas ricas en GC. qPCR: técnica que va midiendo cantidad de Cdna en tiempo real. Ventajas: análisis en tiempo real. Mayor precisión, resolución y sensibilidad. Discrimina por tamaño y secuencia. Reduce variabilidad y contaminación. Detección: Por sondas específicas que solo imiten fluorescencia con un fragmento amplificado. 3 tipos. Sondas de hibridación A, Hidrolisis B, Horquilla C. Se basan en trasferencia de energía entre fluoróforos. Dos partes, Donador (Reportero) y aceptador (apagador). Apagador absorbe fluorescencia de reportero, se puede detectar por foto detector. Sondas hibridación, Este sistema sigue la señal del fluorofo aceptor, en las sondas hidrolisis sigue la señal del reportero. Sonda de Horquilla, zona 5” con reportero y 3” apagador forman Horquilla, altamente especifica. Al unirse la secuencia horquilla se extiende aumentando distancia permitiendo fluorescencia. Ej: TaqMan o 5” nucleasas. Uso SYBR Green: Es un fluoróforo k se une a ADN doble hebra. Muy sensible, por lo k requiere un punto previo para la PCR no amplifique productos inespecíficos. Curva de amplificación de PCR: 3 fases, 1 de latencia, no se detecta acumulación de producto, fase exponencial (Aumenta ADN amplificado y señal fluorescente. Fase de saturación. Transcripción reversa: genera una copia reversa de hebra de ARN, resitente a t°. Pasos RT-PCR: 1-RT de unión a ARN, 2- RT polimera incorpora ns. 3-Fin de RT, 4- PCR.

Clonamiento de ADN

Clonamiento de ADN: Ing genética, k inserta un frag de ADN o Cdna, se une a otra molecula circular (Plásmido) y produce un ADN recombinante. Plásmido se introduce para que se replique y obtener copias. Plásmidos: Replicones autónomos que les permite ser útiles vehículos de clonación de genes, tamaños variables, contienen gases esenciales, dan ventaja adaptativa (resistencia). ¿Cómo abrir plásmidos? Enzimas, Endonucleasas de ADN, o enzima de restricc, tijeras moleculares que cortan ADN doble sin dañar bases. Función biológica: protección de ataque viral. Bases metiladas protegen de hidrolisis. Reconocen secuencia palíndroma, iguales de adelante hacia atrás y al revés. Tipos de Corte. Con extremos cohesivos: se producen extremos sobresalientes de ADN de cadena simple que puede unirse a sec. compl. Con extremos Ramos: genera dos extremos de cadena doble. Tipos de Endonucleasas: Tipo I: Una sola enzima, reconoce ADN, metila y restringe en sitios al azar. Tipo II: realizan restricción y modificación. Restricción en sitio de reconocimiento. Son ocupadas para clonar genes, ya que permite rompe ADN de sitios específicos. Tipo III: Similar al Tipo I, utilizan enzima ologomerica, rompen el ADN 25-27 bases mas alla del sitio de reconocimiento. Una vez cortador se deben unir: Enzima Ligasa: une fragmento. Une covalente# los extremos 5-fosfato y 3-hidroxilo. 

Explicación de experimentos de laboratorio

UD realiza una exp de lab, que le permitera calculas el % de deslizante para mejorar el flujo, explique como dett el %.R: mediante la medición del angulo de reposos a distintas cc de deslizante en la mezcla.

Porque es necesario calcular el factor de desplazamiento de los API. R: porque tienen densidantes distinatas, el factoe de desplazamietno nos permite encontrar una equivalencia entre la masa de cada materia prima conrespecto a su V, nos dice cuanto excipiente requiero para completar una capsula dep de la dosis.

En la masa gel para elaborar capsulas duras y blandas se agrega preservante porque?. R: preservante se usa ya que el agua y gelatina son medio de cultivo de crecimiento biológico, preserva evita crecimiento.

UD debe elabora 60 capsulas, para paciente pedriatrico, dosis 5mg, droga fotosensible. A- elija la que ocuparía. R: Al ser pedriatrico la mas pequeña, coleareada para evital el paso de la luz, capsula 3 blanco/verde. B- debe pesar 165 mg de excipiente por capsula, indique los g por cada componenete. R: 5mg x 60= 300mg =0,3g. 165mgx60 = 9900mg = 9,9g. C- describa como mezclaría los componentes de la formaulacion para asegurar uniformidad. R: Por dilución geométrica.