Optimización del Análisis de Compuestos Orgánicos en Muestras Biológicas: Caso del Hígado Porcino

Muestreo y Preparación de la Muestra: Hígado Porcino

ORG-SOL(aq): Para el análisis del hígado porcino, se inicia el proceso en el matadero, lugar de procedencia de la muestra. Dado que no se dispone de información previa sobre la distribución del analito, se adopta una estrategia de muestreo probabilístico. Se seleccionan muestras al azar, buscando que sean representativas del conjunto del material a analizar.

Las muestras de hígado se transportan al laboratorio en recipientes de vidrio. El uso de vidrio previene la contaminación positiva (transferencia de constituyentes del recipiente a la muestra) y negativa (adsorción del analito en las paredes del recipiente), crucial al tratarse de un compuesto orgánico.

Submuestreo y Homogeneización

En el laboratorio, se realiza un submuestreo de la muestra bruta, manteniendo la representatividad considerada en la etapa inicial. Se tiene en cuenta la posible concentración heterogénea del analito en diferentes zonas del hígado. Posteriormente, al ser una muestra sólida de tejido animal, se procede a la homogeneización para obtener el menor tamaño de partícula posible.

Extracción y Disolución

La masa procesada se introduce en un vial con un disolvente de máxima solubilidad para el analito. Se utiliza un desintegrador de ultrasonidos para provocar la rotura tisular mediante la vibración de las moléculas del sólido.

Eliminación de Interferencias: Extracción Sólido-Líquido

En esta etapa, se busca separar el analito de las interferencias (aumentar selectividad) y preconcentrar el analito (aumentar sensibilidad). Se emplea una extracción sólido-líquido con dos fases:

• Fase I: Líquida (analito + interferencias).
• Fase II: Sólido adsorbente homogéneo dispuesto en columna.

Se ensaya el paso de la fase líquida a través del sólido adsorbente mediante presión negativa (filtración al vacío), buscando retener un analito de naturaleza apolar. Se investigan interacciones con sólidos apolares, donde se presentan fuerzas de Van der Waals entre los grupos CH del sólido y del tóxico. Para la elución del analito, se utiliza un disolvente de mayor solubilidad.

Selección del Sólido Adsorbente

Se selecciona un sólido adsorbente que ofrezca una buena interacción con el analito. El proceso incluye:

1. Etapa de activación: Se pasa un volumen de disolvente (metanol), 2 o 3 veces el volumen de la fase a procesar, a través de la columna a flujo constante. Esto abre las cadenas hidrocarbonadas del sólido, facilitando la entrada del analito a los puntos activos.
2. Eliminación del exceso de disolvente: Se elimina el exceso de metanol mediante arrastre con el disolvente en el que se encuentra la muestra problema.
3. Etapa de carga: Se hace pasar el analito a través del sólido adsorbente activado para su retención, optimizando también la retención de los estándares.
4. Lavado: Se utiliza un disolvente más apolar que el sólido para extraer el analito.
5. Test de la matriz blanco: Se analiza una porción de la muestra blanco con el sólido adsorbente seleccionado (C18) para evaluar la matriz. Se mide la señal a la entrada y salida de la columna para determinar la especificidad del sólido respecto al analito.
6. Test de la matriz espicada: Se añade una cantidad conocida de otro analito a la matriz libre de analito y se somete al proceso de extracción. Esto simula una muestra problema de concentración conocida, permitiendo evaluar la retención de los analitos en presencia de la matriz.

Separación Cromatográfica

Dado que se trata de un compuesto orgánico en una matriz con actividad enzimática susceptible a metabolismo o transformación, se realiza una separación cromatográfica. Se elige una cromatografía líquida basada en las propiedades fisicoquímicas de la fase móvil. La fase estacionaria es de naturaleza sólida (Cromatografía de adsorción).

Cromatografía Líquida de Columna

Se lleva a cabo una cromatografía líquida de columna en modo isocrático (misma fase móvil durante todo el desarrollo cromatográfico) y normal (fase móvil apolar, fase estacionaria polar).

Detección

Se utilizan dos detectores en línea:

1. Detector de UV absorción molecular: La interacción radiación-materia produce un espectro de radiación continua específico del analito. Se utiliza una cubeta de cuarzo como soporte. La espectroscopia de absorción molecular es una técnica universal, permitiendo analizar una amplia gama de compuestos.
2. Detector de fluorescencia: Basado en la emisión de radiación electromagnética. Si el analito no presenta fluorescencia natural, se realiza una derivatización para obtener una especie fluorescente. La cubeta sigue siendo el soporte de la muestra. La fluorescencia es más sensible y selectiva que la absorción.

Cuantificación: Método del Patrón Interno (PI)

Se elige el método del patrón interno para la cuantificación, debido a los posibles errores en la inyección de la muestra con jeringa. Se añade la misma cantidad de patrón interno a cada disolución patrón y a la muestra problema. Se mide la señal analítica y se realiza un ajuste lineal representando la relación señal A/señal PI frente a la concentración del analito. La relación señal A/señal PI de la muestra problema se interpola en el ajuste lineal para determinar su concentración.