Microscopis: instruments d'observació òptica

Microscopis: instruments d'observació òptica

Els microscopis són instruments d'observació òptica que ens permeten obtenir imatges d'objectes, mostres, cèl·lules, etc. augmentades. Amb aquest instrument podem estudiar l'estructura i funcionament de les cèl·lules, dels seus orgànuls i ens permet conèixer la mida de les diferents estructures cel·lulars.

Parts del microscopi: Estructural

Peu, Platina i Platina mòbil. Elements mecànics: Tub, Revòlver i Cargols d'enfocament (macromètric i micromètric). Elements òptics: Ocular, Objectius secs i d'immersió. Augments totals = Augments objectiu x Augments ocular

LUPA --> Produeix una imatge augmentada fins unes 20 vegades més gran (x20) MICROSCOPI DE CAMP FOSC --> Per analitzar elements biològics transparents i sense pigmentar, invisibles sota il·luminació habitual. MICROSCOPI DE CONTRAST DE FASES --> Permet observar les cèl·lules sense colorants. És útil per cèl·lules vives perquè molts organismes vius no poden ser tenyits ja que poden danyar l'estructura cel·lular. MICROSCOPI DE FLUORESCÈNCIA --> Permet observar estructures fluorescents, naturals o artificials marcades amb fluorocroms. Els fluorocroms són colorants fluorescents utilitzats en investigació.

Els microscopis electrònics utilitzen electrons (e-) en lloc de llum visible. Aquests poden ser m.e. de transmissió o m.e. de rastreig. TRANSMISSIÓ --> ens permeten tenir una informació més precisa de l'ultraestructura de les cèl·lules. Les imatges que ens proporcionen són en 2D i en blanc i negre. Les mostres observades són mortes ja que no es poden observar mostres vives. En comptes de lents, tenen electroimants. El filaments genera un flux d'e- que travessen la mostra i són projectats sobre una pantalla fluorescent generant-se una imatge de punts en blanc i negre. DE RASTREIG --> ens proporcionen una imatge en relleu (com una lupa binocular), els electrons no poden travessar la mostra perquè està recoberta amb una capa d'or molt prima. Els feix d'e- és molt més estret que en el de transmissió i en xocar la mostra provoca que s'emetrin e- secundaris que són els que es veuen a la pantalla. Les seves imatges permeten l'observació tridimensional dels objectes.

Poder resolució: - ull humà 0.1 mm - Micro òptic: 0.5 um - Micro elèctric: 2-0.2 nm Nombre d'augments = MA / MR

Procariotes

Aquestes cèl·lules no tenen un nucli ben diferenciat i per tant el material hereditari (ADN) es troba dispers pel citoplasma, en el nucleoide. A més posseeixen membrana nuclear. Són cèl·lules molt senzilles, no formen teixits ni organitzacions superiors i solen ser més petites que les cèl·lules eucariotes. Components de la cèl·lula: - La membrana plasmàtica: està formada per lípids i la seva funció és seleccionar els materials que entren i surten de la cèl·lula. - Citoplasma: on es troba l'ADN bacterià o cromosoma que manté i conserva la informació genètica de la cèl·lula i en dirigeix el funcionament. També podem trobar fragments d'ADN extracromosòmic als plasmidis. - Ribosomes: són partícules globulars que actuen en la síntesi de les proteïnes. També podem trobar-ne les inclusions, que són grànuls de reserva on la cèl·lula sintetitza en èpoques de molt aliment, o bé residus del metabolisme. - Paret cel·lular: té la funció de protegir i donar rigidesa a la cèl·lula, se situa al voltant de la membrana plasmàtica. Té un gruix variable i té funcions de defensa, adhesió, nutrició i protecció contra la dessecació. - Els flagels: són prolongacions que poden tenir una longitud varies vegades la longitud de la cèl·lula. Intervenen en el moviment cel·lular i en la conjugació, com el pilus sexual que són flagels més curts i abundants i la seva funció és la d'unió a un substrat, altres bacteris o cèl·lules eucariotes.

Eucariotes

Aquestes cèl·lules tenen el nucli ben diferenciat i per tant, el material hereditari (ADN) es troba tancat dins la membrana nuclear. D'aquest tipus de cèl·lula, podem diferenciar les cèl·lules animals i vegetals.

Cèl·lules animals

A diferència de les cèl·lules vegetals aquestes manquen de paret cel·lular i de cloroplasts, els seus vacúols són molt petits i posseeixen centrosomes (orgànuls relacionat amb la presència de cilis i flagels). Elements de la cèl·lula: - Nuclèol: és una estructura esfèrica dins del nucli on es produeixen ribosomes i es transcriu l'ADN ribosòmic (ADNr). - Nucli: conté les instruccions pel funcionament cel·lular i l'ADN. - Ribosomes: responsables de la fabricació de proteïnes. - (RER): envolta el nucleoplasma (memb. nuclear), conté ribosomes i en intervén en la síntesi de proteïnes i lípids, també fa la funció d'emmagatzemar i transportar subst. dins la cèl·lula. - (REL): és una xarxa llisa sense ribosomes que està adherida a la memb. cel·lular i s'estén per tot el citoplasma. Hi sintetitza gairebé tots el lípids que formen les membranes.

Aparell de Golgi: és una xarxa de canals i vesícules que transporten substàncies fins a l'exterior de la cèl·lula. - Citoesquelet: és una xarxa de filaments que envolta i dona forma a la cèl·lula - Mitocondris: són orgànuls cel·lulars de forma allargada i estan repartits pel citoplasma, dins tenen ADN i ARN. La seva funció és la respiració cel·lular i el metabolisme. - Vacúols: encarregats d'emmagatzemar subst. de reserva o citotòxiques. - Citoplasma: és el medi cel·lular entre la memb. plasmàtica i la memb. nuclear. - Lisosomes: són vesícules on es realitza la respiració cel·lular. - Centríols: intervenen en la divisió i el moviment cel·lular.

Cèl·lules vegetals

A diferència de les cèl·lules animals, aquestes tenen paret cel·lular i cloroplasts, vacúols molt grans i manquen de centrosomes, cilis i flagels. Ele de la cèl·lula: - Cloroplasts: són orgànuls de color verd ja que contenen clorofil·la, subst. la qual realitzen la fotosíntesi. - Vacúols: són de mida gran i tenen la mateixa funció que a les c. animals. - Paret cel·lular: està formada per cel·lulosa (glúcid) i protegeix i dóna forma a la cèl·lula

Característiques dels bacteris

Les cèl·lules bacterianes es multipliquen a gran velocitat i la seva mida n'és molt diminuta (entre 0.1 i 0.6 µm). Les seves reaccions metabòliques es produeixen a elevades velocitats i les seves deixalles s'eliminen ràpidament. Són les cèl·lules més abundants i antigues del planeta. Moltes d'aquestes cèl·lules estan capacitades de formar espores. Aquestes cèl·lules es poden classificar segons la seva adaptació al medi: - Bacteris termòfils (superiors als 45ºC) psicròfils (inferiors als 20) mesòfils (entre 15ºC i 45ºC) O també pel seu consum d'oxigen: Anaerobis (capaces de sobreviure i multiplicar-se en ambients sense presència d'oxigen) Aerobis (només poden sobreviure i multiplicar-se en ambients amb presència d'oxigen) Aerobis facultatius (poden sobreviure i multiplicar-se tant amb presència com en absència d'oxigen)

Flagels: són els que donen moviment a la cèl·lula mitjançant el moviment en espiral. Fimbries: són les que els bacteris utilitzen per adherir-se a substrats, a altres cèl·lules bacterianes o cèl·lules eucariotes. Pilus sexual: és el que facilita el procés de conjugació, és a dir, la transferència d'ADN d'un bacteri a un altre.

Matèria: la font d'energia és el C i els bacteris es poden esdevenir Autòtrofs (si la font prové del CO2) o Heteròtrofs (si la font prové dels compostos orgànics).

Energia: la font d'energia pot ser la llum o les reaccions químiques i els bacteris es poden esdevenir Fotòtrofs (si la font es la llum), Litòtrofs (si la font són les reac. de compostos inorgànics) o Organòtrofs (si la font són les reac. de compostos orgànics), aquests dos últims són anomenats Quimiòtrofs

Bacteris GRAM +: Aquests bacteris disposen d'una paret gruixuda formada per peptidoglicans units entre si a polisacàrids i àc. teicoics. La seva tinció es color violeta ja que el colorant queda atrapat dins la capa de peptidoglicà de la paret bacteriana. Això és gràcies a que els colorants insolubles del tint queden atrapats entre les capes de peptidoglicans. Aquest tipus de bacteris solen ser bacteris patògens causants de malalties greus.

Bacteris GRAM -: Aquests bacteris disposen d'una paret estreta, formada per peptidoglicans i envoltada per una bicapa lipídica (o membrana externa). L'espai intermembrana (m. interna i m. externa) s'anomena periplasma i es on se situa la capa de peptidoglicans. A la membrana externa podem trobar porines que actuen com a canals d'intercanvi cel·lular. La seva tinció es color rosa i això és degut a que la capa estreta de peptidoglicà rebutja el colorant del cristall violeta quan s'afegeix alcohol/acetona, llavors el citoplasma queda incolor i al afegir safranina, queda tenyit de rosa.

DIFERÈNCIES : Els bacteris G+ posseeixen àc. lipoteicoics i àc. teicoics, una capa gruixuda de peptidoglicà i mem. plasmàtica. Els bacteris G- no posseeixen aquests àcids però tenen porines i una bicapa lipídica

Creixement bacterià: El creixement bacterià es pot definir com l’augment del nombre de bacteris. La velocitat a la qual es produeix el creixement bacterià depèn de cada espècie, del mitjà de cultiu i d’altres condicions. Depenent del nombre de microorganismes, parlem de poblacions (en procariotes), colònies o cúmuls. FASES : Latència: També fase d’adaptació, prèvia a mitosi. Els microorganismes (m.o.) sintetitzen nous components. La fase varia segons el tipus de m.o. i el medi. Al final de la fase, comença la mitosi. 

LOG: Els m.o. creixen i es divideixen (mitosi) fins al màxim possible en funció del mat. genètic, el medi i les condicions de creixement. La v de creixement és constant.  És uniforme química i físicament (per això els cultius s’utilitzen en investigació) Estacionaria: El creixement cessa i la corba es torna horitzontal. El nº de m.o. viables és constant (equilibri divisió-apòptosi).Mort: Disminució del nombre de cèl·lules viables. Apòptosi.

Procediment tinció : Extensió/Frotis: Per obtenir una pel·lícula homogènia de la mostra. Dessecació: Eliminem l’aigua de la mostra. Fixació: Matem els bacteris sobre una flama d’un bec de Bunsen o per immersió. Tinció: Afegim el colorant a la mostra. Rentat: Eliminem l’excés de colorant de la mostra. Assecat: Eliminem les restes del líquid de rentat, utilitzem paper o aire. Observació: Observem la mostra al microscopi. MEDIS DE CULTIU -->  conjunt de nutrients en aigua aptes pel desenvolupament de microorganismes. Aquests medis contenen nutrients, agents tamponants (pH adequat), estèrils i altres substàncies. Els medis de cultius es poden classificar segons els nutrients que tenen: Macronutrients: Tenen una major quantitat de nutrients, imprescindibles pel desenvolupament com: C, N, P, K, Fe, S, Mg, Na, Ca… Micronutrients: Tenen una menor quantitat de nutrients que són imprescindibles pel desenvolupament com: Co, Cu, Mn. Factors de creixement: Aquests són necessaris pel desenvolupament com la Biotina (B7) i la Riboflavina (B2
Els medis de cultiu també tenen components inhibidors del desenvolupament com: Antibiòtics: Maten els bacteris (Els antibiòtics NO són resistents a les temperatures d’esterilització, és a dir, són termolàbils). 
Bacteriostàtics: Anul·len la seva reproducció. A més, els medis de cultiu, tenen components indicadors que ens indiquen el canvi de pH del cultiu, encara que alguns d’aquests indicadors de pH, poden actuar com bacteriostàtics com el cristall violeta. Estat físic - Sòlids: >1% gelificant  - Semi-sòlids: components, a partir de pols deshidratades Reactius: NO estiguin caducats i estiguin en bones condicions, hem de tapar ràpidament després d’utilitzar-los. Material de vidre: Estigui net i sec. pH: Sigui el correcte i adjustar si és necessari. Calor: Escalfar correctament el medi fins la seva dissolució. Aigua destil·lada: Hem d’addicionar aigua destil·lada per tal que no quedi pols a les parets de la preparaci.

Medi NO autoclavable: El bullim durant 1-2 minuts i el portem a 48-50ºC en un bany d’aigua. Tot seguit, plaquejem.
Medi autoclavable: Si utilitzem plaques de Petri, marquem l’ampolla amb paper reactiu de control, autoclavem durant 15 minuts a 121ºC i el portem a 48-50ºC en un bany d’aigua. Finalment, plaquejem.
Si utilitzem tubs d’assaig, omplim els tubs fins la meitat, marquem amb paper reactiu de control i autoclavem durant 15 minuts a 121ºC, el portem a 48-50ºC i per últim, els refredem ja sigui inclinats o verticalment.

ELIMINACIÓ DELS MEDIS DE CULTIU
Esterilitzar: A l’autoclau, incinerar els organismes patògens o submergir en una dissolució desinfectant
Llençar a les escombraries: Podem llençar a les escombraries el material i els residus fungibles.
Rentar: Podem rentar el material de vidre per poder reutilitzar-lo.

Gram 

1. Frotis i fixación    2. Tinció I i rentar   3. Lugol i rentar4. EtOH i rentarn     5. Tinció II i rentar   6. Assecar i observar   

 Ziehl

1. Frotis i fixació      2. Tinció I: Fucsinan  3. Alcohol-Àcid i rentar 4. Tinció II: Blau de metilè i rentar, assecar i observar