Métodos de Separación y Purificación de Proteínas: Fundamentos Físico-Químicos

Fundamentos de la Separación de Proteínas

Las proteínas se separan y evalúan según sus propiedades físico-químicas, las cuales reflejan la naturaleza de sus aminoácidos. Los criterios principales son:

• Tamaño: El peso molecular, es decir, la masa que depende del número y tipo de residuos que posea la proteína.
• Carga: Depende del estado de ionización de sus aminoácidos básicos y ácidos. Asimismo, está condicionada por el pH de la disolución, ya que cada proteína presenta un pI (punto isoeléctrico), pH al cual la carga eléctrica de la proteína es nula.
• Forma: La proteína es un polímero que puede adoptar distintas conformaciones. Se puede caracterizar mediante el radio de giro, definido como la raíz cuadrada de la distancia media de los átomos que la forman al centro de gravedad del sistema (mayor en proteínas fibrosas que en globulares).

Técnicas de Separación

Diálisis

Es un método de tamizado molecular que utiliza membranas semipermeables, como la celulosa porosa, para separar moléculas en función de su peso molecular. Las moléculas grandes no atraviesan la membrana, mientras que las pequeñas sí. Al colocar la muestra en una membrana de diálisis dentro de una solución concentradora, solo las moléculas pequeñas logran atravesar la barrera.

Cromatografías

Cromatografía de filtración en gel

La columna se rellena con esferas porosas de polímeros insolubles pero muy hidratados (como Sephadex o Sepharosa). Se basa en el peso molecular. También se conoce como cromatografía de filtración molecular inversa, pues las moléculas mayores eluyen en primer lugar al no ser retenidas en el interior de las esferas del gel, fluyendo con mayor rapidez.

Cromatografía de intercambio iónico

Las esferas porosas de polímeros se modifican químicamente para contener grupos cargados a un pH cercano a la neutralidad. Las proteínas con carga neta opuesta a la de los grupos de la columna quedarán retenidas (por ejemplo, el intercambio catiónico posee grupos negativos en la columna). Una vez eluidas las proteínas no retenidas, se aumenta la concentración de sal en el eluyente para que los iones (Na+ o Cl-) compitan por los grupos cargados de las proteínas, permitiendo su separación en función de su densidad de carga.