Métodos de diagnóstico virológico: técnicas directas e indirectas para identificar virus

Métodos de diagnóstico virológico

Métodos directos

1. Virus como partícula viral (ME)

2. Virus como agente infeccioso (aislamiento viral)

3. Presencia de antígenos (AG) virales (técnicas inmunológicas: inmunofluorescencia, test de aglutinación)

4. Presencia de ácidos nucleicos (técnicas de biología molecular: PCR)

ME → necesita alta cantidad de viriones (10⁹ partículas virales/ml). Heces o diarrea: resultados positivos RÁPIDOS → ROTAVIRUS, ADENOVIRUS, CORONAVIRUS.

1. Aislamiento viral: cultivos celulares

(Sensibilidad y especificidad muy altas, ya que solo se amplifica el virus)

• a partir de tejido/órgano
• Monocapa celular (crece en un medio de cultivo complejo: albúmina, vitaminas, sales)

Cultivos celulares:

• Cultivo primario: células, tejidos u órganos. SUBCULTIVAR 1 o 2 veces.
• Línea primaria: tejido/órgano que crece hasta ~50 subcultivos (limitado).
• Línea celular continua: tejido/órgano (tumoral) que se mantiene en cultivo de forma ilimitada.

1. Inoculación del virus en el sistema celular elegido.
2. Incubación a 35-37 °C durante hasta 14 días; observaciones a las 24, 48 y 72 h y después dos veces por semana (monitorización).
3. Comparar con cultivos no inoculados (buscar cambios morfológicos: efectos citopáticos, etc.).

No se observan los virus directamente, sino los efectos sobre la célula huésped.

- La muestra se coloca en el tubo y se centrifuga (acelera la penetración del virus en la célula). A las 48 h de incubación ya podemos identificar las proteínas del virus mediante anticuerpos monoclonales específicos marcados con fluorescencia.

El cultivo celular se realiza en monocapa de células activas que se adhieren a la superficie de un tubo fresco o cubreobjetos contenido en un shell vial de fondo plano.

2. Inmunofluorescencia directa

Se usa para identificar rápidamente el virus directamente sobre la muestra.

- Porta: preparar la muestra (secar y fijar).

- Añadir anticuerpos marcados con partículas fluorescentes.

3. Test de aglutinación directo

→ Detecta antígenos virales en muestras clínicas.

1. Anticuerpos antivirales específicos fijados en eritrocitos o partículas de látex.
2. El reactivo se incuba con la muestra donde se investiga el antígeno.
3. Si hay aglutinación de partículas = presencia de antígeno (requiere pruebas complementarias).

Se usa sobre todo para detectar antígenos de rotavirus en heces. Rápido y barato.

4. PCR

PCR - Identifica material genético vírico (ADN). RT-PCR: ARN. Amplificación de copias para detección.

Métodos indirectos

1. Producción de anticuerpos in vitro

2. Detección de anticuerpos específicos antivirales por técnicas inmunológicas (inmunofluorescencia indirecta, Western blot)

1. Producción de anticuerpos in vitro

Producción de anticuerpos (in vitro).

• Diagnóstico de la infección perinatal (transmisión de madre a hijo durante la gestación).
• Diagnóstico temprano de niños afectados por el VIH.

Se puede determinar si la persona produce anticuerpos antivíricos mediante linfocitos B extraídos de la sangre total; esto indica que el sistema inmunitario ha sido estimulado por el virus.

2. Detección de anticuerpos específicos antivirales

Western blot

Diagnóstico del VIH.

Separa electroforéticamente proteínas virales que luego se inmovilizan en papel de nitrocelulosa para determinar la presencia de anticuerpos específicos contra cada una de estas proteínas.

1. Cultivo celular con grandes cantidades de virus → se inactivan → los antígenos resultantes del lisado viral se separan por electroforesis.
2. Antígenos separados → transferencia a membranas de nitrocelulosa.
3. Suero del paciente → membrana → anticuerpo anti-Ig conjugado a peroxidasa o fosfatasa alcalina → sustrato → bandas reactivas coloreadas.

Inmunofluorescencia indirecta

Detecta anticuerpos antivirales en suero. Método rápido.

Porta: fijación de antígenos virales expresados en la superficie y citoplasma de células infectadas.

1. Incubación del suero con células infectadas y no infectadas.
2. Agregar anticuerpo anti-IgG humana marcado con fluorescencia.
3. Si es positivo: el conjugado se une a los anticuerpos del paciente y, al observar en el microscopio de fluorescencia, se aprecia fluorescencia en citoplasma y superficie de las células.

Test de aglutinación indirecto

Se buscan anticuerpos virales usando partículas de látex recubiertas de antígeno viral.