Mètodes d'Identificació Bacteriana i Micològica al Laboratori

Introducció a la Identificació Microbiana

La identificació es basa en les característiques metabòliques (per determinar gènere i espècie) i en les característiques d'estructura antigènica (serovar). Molts cops les proves metabòliques, bioquímiques i fisiològiques s'han de complementar amb les serològiques.

1. Mètodes amb Medis Convencionals

Aïllament dels bacteris: en plaques o en tubs amb medis diferencials o selectius. Quan creixen les colònies es sembren en altres medis de cultius més específics o si no amb altres tècniques.

Exemple de medis indol-ura: Per veure si els bacils gram-, enterobacteris, aïllats d'una placa, poden degradar triptòfan en indol i també ens permeten veure si metabolitzen la urea per tenir triptofanasa i urasa. És un medi líquid i es deixa incubar a 37 ºC durant 24 hores. El tub original és de color groc i conté urea; si és metabolitzada, vira a color vermell violaci. S'afegix el reactiu de Kovacs: si es produeix indol per metabolisme del triptòfan, es forma una anella vermella al voltant del tub.

1.1. Prova de Voges-Proskauer

Per a cocs gram+ i bacils gram-. Determina quins produeixen 2,3-butandiol a partir dels hidrats de carboni. Es determina la cetona, que és un metabòlit intermediari. Es cultiva a 37 ºC durant 24 hores. S'afegixen 2 reactius: la solució d'alfa-naftol i hidròxid potàssic al 40%. Es deixa el tub obert i inclinat per incrementar la superfície en contacte amb l'aire. Si dona positiu (+), el tub és de color vermell-rosat; si dona negatiu (-), el tub és de color groc inicial.

1.2. Prova del Citrat de Simmons

Permet veure si els bacils gram- enterobacteris utilitzen els citrats del medi. Els que utilitzen el citrat com a font de carboni podran créixer. El medi és d'agar líquid en tub, per tant, es sembra en picadura i a les 24 hores de la incubació a 37 ºC mirem si hi ha creixement o no. El medi conté blau de bromotimol, que a pH neutre és de color verd; si s'han utilitzat els citrats del medi, vira a un color blau.

1.3. Vermell de Metil

S'utilitza per identificar enterobacteris fermentadors d'hidrats de carboni (poden viure en condicions d'anaerobiosi). S'afegixen els bacteris dubtosos al medi a 37 ºC durant 24 hores. Si hi ha fermentació, canvia el color degut a modificacions del medi. Si és vermell + => color vermell; si és vermell - => color groc.

1.4. Prova dels Nitrats

S'utilitza per a bacils gram- i permet veure la reducció dels nitrats que hi ha al medi ($NO_3 ightarrow NO_2 ightarrow N_2$). S'utilitza per identificar enterobacteris i micobacteris. El medi pot ser líquid o agar inclinat. S'incuba 24 hores a 37 ºC. A la lectura de la prova s'hand d'afegir 2 reactius: alfa-naftilamina i àcid sulfanílic. Un cop afegits els reactius, si el tub es torna vermell serà que és positiu (+). Si és negatiu (-), no haurem d'observar el color vermell, però hem de fer un pas més: comprovem si s'ha acabat la reacció afegint pols de zinc. Si afegim pols de zinc i es torna vermell, vol dir que assegurem la prova negativa degut a què fa la reacció $NO_2 ightarrow N_2$ i per tant indica que ja hi havia $NO_3$ des d'1 principi. Si es queda de color original (groc), direm que és positiu.

1.5. Prova de Kligler

Identificació d'enterobacteris fermentadors de lactosa, glucosa i productors de sulfur d'hidrogen. En un tub d'agar inclinat, es sembra en picadura i es fa estria a la superfície. S'incuba a 37 ºC durant 24 hores. S'observa el medi i es mira si els bacteris han utilitzat els sucres del medi. En principi el medi tant a baix com a dalt és vermellós, llavors mirem si a baix (glucosa) o a dalt (lactosa) s'ha produït la reacció. A part, mirarem si s'ha produït sulfur d'hidrogen i la producció de gas.

1.6. Prova O/F (Oxidació/Fermentació)

S'utilitza per determinar cocs gram+ i bacils gram-. Permet veure si els bacteris sembrats necessiten $O_2$ per viure o no. Es sembra en 2 medis en picadura i es mira (un cop incubat 24 hores a 37 ºC) si hi ha creixement o no. Un dels 2 tubs es tapa amb parafina (per fer anaerobiosi). Als 24 hores es mira el creixement (vira a color verd). Els resultats poden ser: +/+; +/-; -/+ o -/-. En funció d'aquesta i altres proves determinarem el microorganisme.

1.7. Prova de la Fenilalanina (P.E.)

En un tub de medi d'agar sòlid inclinat, serveix per a la identificació d'enterobacteris. Permet veure si el bacteri utilitza la fenilalanina del medi. Es sembra per picadura i estria i s'incuba a 37 ºC durant 24 hores. Passades les 24 hores s'afegix el reactiu clorur de ferro i es mira el canvi de color. Si és a verd intens és positiu (+) i si es manté el color groc inicial és negatiu (-).

1.8. Prova de Producció de Gasos

Es treballa en un tub amb campana de Durham. Es fa la sembra i incubació 24 hores a 37 ºC i passat aquest temps es mira a l'interior de la campana. Si el bacteri produeix gas, es veurà una bombolla dins de la campana. Si la campana no conté gas, és clau que el bacteri no l'ha produit. S'utilitza per diferenciar enterobacteris.

1.9. Prova de la Gelatinasa

(No s'utilitza gaire). És per identificar bacils gram- no fermentadors. Permet veure si els bacils presenten l'enzim gelatinasa que trenca la gelatina del medi dels pèptids que la formen. És un tub d'agar inclinat, amb sembra de picadura i estria. S'incuba a 22 ºC durant unes 6 setmanes si cal. Serà positiu si el medi s'ha liquefet i serà negatiu si es manté gelatinós.

1.10. Detecció d'Acetona o Medi de Clark-Lubs

S'utilitza per a la detecció de bacils gram-. En el medi hi ha glucosa i es busca la via per la qual és atacat. Si utilitzem la via butanodílica es produeix molta acetona. Es fa la sembra i es deixa a 37 ºC durant 48 hores. El tub inicialment és groc i un cop incubat s'afegixen els reactius de Voges-Proskauer durant 10 minuts. Si és positiu donarà un color vermell; si és negatiu es quedarà de color groc.

2. Identificació amb Galeries d'Identificació

Són pouets on estan els reactius deshidratats. es posen els microorganismes en cada pouet i s'incuba. És molt important treballar amb cultiu pur. Un cop feta la suspensió bacteriana i s'ha carrrigat la galeria, es sembra una placa de Petri per a confirmar que és un cultiu pur.

2.1. Enterotube

Té diferents compartiments amb un reactiu diferent. S'utilitza per a la identificació d'enterobacteris i també altres bacteris aerobis i anaerobis facultatius gram- oxidasa -. Un cop s'ha sembrat s'incuba durant 24 hores a 37 ºC.

2.2. APIs (Sistemes estandarditzats)

(Són els més utilitzats actualment). És un sistema d'identificació en una sèrie de tests bioquímics estandarditzats i tenen bases de dades per a fer la lectura. En els panells hi ha els substrats de les reaccions que volem que es donin i estan deshidratats. La suspensió del microorganisme que volem identificar ha de ser a 0.5 McFarland. Quan tens aquesta concentració el poses en els pouets (hi ha 3 maneres de col·locar-ho). És millor el treball en una atmosfera humida, per això es cultiven en unes cabines especials. Hi ha per diferents tipus de microorganismes. La temperatura i temps d'incubació varia segons l'API. Més enllà d'incubaments, ens pot donar un canvi de color directament o se li han d'afegir reactius després per a veure si canvia de color. Són unes 20 proves i es van llegint de 3 en 3 donant diferents puntuacions. Després, amb aquestes puntuacions podem identificar el microorganisme.

2.2.1. API 10

S'utilitza per enterobacteris i altres gram-. Consta de 10 proves bioquímiques i s'incuba a 37 ºC durant 24 hores. En la cambra d'incubació es posa aigua per crear l'atmosfera humida.

2.2.2. API-20E

Per enterobacteris i bacils gram- en general. Són 20 proves bioquímiques i s'incuben durant 24 hores a 37 ºC.

2.2.3. API-20A

Per bacteris en anaerobiosi. Són 20 proves bioquímiques. Es posen durant 48 hores a 37 ºC en unes bosses d'anaerobiosi. Es pot mirar el resultat a les 24 hores, però sense obrir la bossa.

2.2.4. API-Staph

Per a la identificació de cocs gram+; catalasa + (Staphylococcus). Es treballa amb una suspensió de les colònies que ens interessa identificar amb sèrum fisiològic que ja està al kit. S'incuba 24 hores a 37 ºC.

2.2.5. API-Strep

Per a cocs gram+ catalasa - (Streptococcus). Es treballa amb un medi líquid que conté el kit. Són 20 proves. La primera part es treballa amb una suspensió d'aigua destil·lada normal i en la segona part es treballa amb el medi líquid del kit. S'incuba 24 hores a 37 ºC en l'estufa de $CO_2$.

2.2.6. API-NH

Per identificació de Neisseria i Haemophilus. Són 10 proves bioquímiques a 37 ºC en atmosfera de $CO_2$ durant 24-48 hores.

2.2.7. Rapid ID 32 E / Rapidc-Z

Per a Salmonella, Shigella i Yersinia enterocolitica. Es treballa a partir de colònies lac -. És una galeria de 10 proves (5 parells de proves). En "a" es fan les proves bioquímiques i en "b" permet el manteniment del cultiu i fer la prova de l'oxidasa.

2.2.8. API Caux (API 20 C AUX)

Per a l'identificació de llevats. Són 20 proves que s'han d'incubar a 30 ºC durant 48 hores, fent una primera lectura a les 24 hores.

3. Identificació amb Pastilles Diagnòstiques

Es treballa sobre medis de cultius o amb tubets amb unes pastilles diagnòstiques que permeten l'aïllament i identificació dels bacteris. La lectura es fa a les 24 hores. Es pot fer tant en placa d'agar com en tub:

3.1. Factors X, V i X+V

Serveixen per a la determinació d'Haemophilus. Es treballa amb placa d'isox o sang. Es poden posar els 3 discos en una placa o en dos plaques (en una els discos X i V i en l'altre el disc X+V). S'incuba en atmosfera de $CO_2$ 24 hores a 37 ºC.

3.2. Factors SPS i Sulfonamida

Per identificar Gardnerella vaginalis. Es treballa en placa de sang o isox i es posen els 2 discos. S'incuba 24 hores a 37 ºC i en atmosfera de $CO_2$. En cas de què sigui Gardnerella vaginalis ho veurem perquè hi haurà creixement al voltant d'una de les pastilles (de la de sulfonamida, perquè l'SPS l'inhibeix).

3.3. Factor Optokina

Es sembra en AS (Agar Sang) i serveix per distingir els pneumococs dels altres tipus d'Streptococcus, ja que aquests són sensibles a l'optokina i farien un anell d'inhibició. Es cultiva 24 hores en estufa de $CO_2$ a 37 ºC.

3.4. Factor Novobiocina

Antibiòtic que permet diferenciar certes espècies d'estafilococs, com Staphylococcus saprophyticus (que és resistent).

3.5. Factor Sucres

Es sembra en agar la suspensió i es posen els discos dels diferents sucres. Cal veure si han crescut al voltant de les pastilles (significa que ho necessiten del medi). Hi ha altres pastilles per a ràpida identificació a 4 hores o 35-37 ºC. Té com a avantatge que és molt econòmic, les pastilles es conserven a temperatura ambient durant diversos dies i es determina per canvi de color del medi. També es pot fer ressuspenent en sèrum i afegint la pastilla. Serveix per distingir enterobacteris i la determinació de Neisseria. És positiu si és de color groc i negatiu si és de color rosa.

3.6. Factor Beta-lactamasa

Si els bacteris produeixen aquest enzim els fa resistents als antibiòtics que contenen l'anell beta-lactàmic (ampicil·lina...). S'utilitza per identificar Haemophilus, Staphylococcus o Branhamella.

3.7. Factor Beta-glucuronidasa / Indol (PGUA)

És específica per a detectar E. coli (per a distingir-la d'altres enterobacteris). Es treballa en un tub amb 0.5 ml de sèrum fisiològic i es suspèn la pastilla. S'incuba 24 hores a 37 ºC. A les 24 hores se li afegix el reactiu de Kovacs.

3.8. Factor Pirrolidonil Aminopeptidasa (PYR)

Enzim per diferenciar les diferents espècies d'Streptococcus. Si és positiu és de color groc i si és negatiu és de color rosa.

3.9. Factor Bilis-Esculina

(Se sol posar amb el PYR). També serveix per a identificar estreptococs. Conté bilis i esculina que ens indica si el bacteri hidrolitza o no. Es cultiva 24 hores a 37 ºC. Si dona positiu és de color negre i si dona negatiu és incolor. La prova també es pot fer en placa i afegir l'antibiograma.

3.10. Factor Hipurat

Per determinar Streptococcus. S'incuba al bany durant 3 hores, se li afegixen 5 gotes del reactiu ninhidrina i es deixa 15 minuts més al bany i es llegeix. Si és positiu dóna un color blau-lilós-negre i si és negatiu és incolor.

3.11. Factor ONPG

Mira la reacció beta-galactosidasa dels bacteris a partir del substrat de les pastilles. Serveix per a la detecció de Shigella.

3.12. Hidròlisi de la Urea i el Citrat

Es fa en 2 tubets per separat. Serveix per a la identificació de bacils gram- lac - juntament amb les proves MIA i Kligler.

4. Identificació Mitjançant la Detecció d'Antígens Bacterians

En molts d'aquests antígens s'han pogut aïllar anticossos per poder-ho enfrontar a l'antigen. No cal sembrar la mostra, es pot fer directament amb la mostra (orina, líquid cefalorraquidi, sèrum...). És important fer-ho servir en pacients amb tractament antibiòtic, ja que ens poden alterar la mostra, o buscar directament en el focus d'infecció o en sèrum (per on circulen) o en orina (per on s'excreta).

4.1. Immunofluorescència Directa

Tècnica de microscòpia. La mostra està sobre la portaobjectes, s'afegix el reactiu que conté els anticossos de l'antigen que busquem marcats amb fluorescència. Es mira al microscopi i s'observen els resultats. Si s'ha produït la unió, es veurà amb el microscopi de fluorescència. S'utilitza molt en virologia perquè les cèl·lules infestades formen aglomerats d'antígens (cossos d'inclusió) que aconsegueixen un tamany considerable. Es tenyeix i es veurien a l'interior de la cèl·lula infectada.

4.2. Proves de Làtex i Coagulació

Tècnica d'aglutinació amb unes partícules microscòpiques de làtex sobre les quals s'han fixat antígens o anticossos contra el que estem buscant. Es pot treballar sobre un vidre o targeta de cartró on es barregen una gota del làtex i una altra del producte patològic que volem detectar. Si hi ha els antígens, es produirà aglutinació. Es solen posar controls positiu (+) i negatiu (-). Es treballa directament amb mostres d'orina, líquid cefalorraquidi i sèrum. També es pot treballar amb colònies aïllades. Serveix per identificar una espècie o veure diferents serotips d'una mateixa espècie.

5. Altres Proves Complementàries d'Identificació

Ens serveixen per a molts tipus de bacteris. De vegades cal fer-les i de vegades no.

5.1. Tècnica de l'Oxidasa

Ens permet diferenciar bacteris anaerobis obligats (són oxidasa -) de la resta. Es detecta la cadena del citocrom completa (ox+) o incompleta (ox-). S'utilitzen diferents reactius. Si és oxidasa + dóna un color lila molt fort i si es queda igual és oxidasa negatiu. Amb una pipeta Pasteur de vidre amb la punta doblada, es sembra en un paper absorbent amb els reactius. S'espera 10 minuts abans de llegir. Tots els bacteris anaerobis patògens per a l'home són ox - i alguns aerobis (sobretot els estrictes) són ox+.

5.2. Tècnica de la Catalasa

Serveix per a la identificació de bacils gram+, micobacteris o per diferenciar Streptococcus d'Staphylococcus. És típic dels bacteris amb metabolisme oxidatiu i són capaços de descomposar $H_2O_2$ en $H_2O$ i $O_2$. Es treballa sobre un portaobjectes amb una gota d'$H_2O_2$ al 30%. Es posa la colònia al costat de la gota i es barreja amb l'$H_2O_2$. Serà positiu si surten bombolles instantàniament, serà negatiu si no surten bombolles i serà positiu dèbil si surten bombolles però li costa un temps.

5.3. Prova Plasmocoagulasa

Per diferenciar l'Staphylococcus aureus de la resta (aquest dóna positiu). S'utilitza plasma humà o de conill. Està liofilitzat i congelat. Es posen els tubs com cal i es sembren les colònies. S'incuben a 37 ºC durant 24 hores. Es pot fer una primera lectura a les 4 hores i es mira si s'ha coagulat. Si està tot líquid serà coagulasa -. Si hi ha un coàgul serà coagulasa +. Si dona un positiu a les 4 hores i negatiu a les 24 és un fals negatiu i cal repetir-ho. Cal fer un control positiu posant ATCC amb S. aureus. També es pot fer sobre un portaobjectes utilitzant hematies sensibilitzades amb fibrinogen que aglutinaran si és positiu (clumping factor) i no aglutinaran si són negatius.

5.4. Test de CAMP

Serveix per a comprovar si els Streptococcus de grup B (S. agalactiae) són beta-hemolítics, produeixen factor CAMP i la hidròlisi de l'hipurat. Els Streptococcus de grup B s'excreten pel factor de CAMP que té una activitat hemolítica sinèrgica amb soques d'S. aureus productors d'hemolisina beta. Es cultiva en una placa d'AS. Es fa una sembra d'amunt fins abaix d'S. aureus i horitzontalment del que es sospita. Es cultiva 24 hores a 37 ºC en l'estufa de $CO_2$. El test de CAMP és positiu si hi ha hemòlisi amb punta de fletxa. Si és negatiu hi ha hemòlisi però no en forma de fletxa.

6. Tècniques Especials d'Identificació

6.1. Llevats

Es miren la morfologia de les colònies, les característiques bioquímiques i la morfologia microscòpica.

6.1.1. Test de Filamentació

Si es veuen colònies en placa grans, mantecoses, catalasa +; solen ser llevats. Per identificar-ho en fresc, es pot observar si fan el tub germinatiu. Si el fan, és Candida albicans. Per fer la prova, es posa sèrum humà en un tubet, s'afegix la colònia i es posa a incubar a 37 ºC durant 2-4 hores. S'ha de mirar al microscopi. Si és positiu presentarà el tub germinatiu i si és negatiu no el presenta, als hores s'ha de fer un Gaux o un auxonograma.

6.1.2. Auxonograma

Prova d'assimilació que estudia la capacitat d'utilitzar diferents sucres com a única font de carboni. Es sembren els llevats que no tinguin altra font de carboni que els nous sucres. Es redisolen en aigua destil·lada i la suspensió es sembra en plaques YNB (semblant al BG o Sabouraud), es mulla un isop en la suspensió i s'estén en la placa en les 3 direccions. Es deixa 10 minuts perquè s'eixugui i es posen els discos dels sucres (sacarosa, trehalosa, rafinosa, lactosa, maltosa, galactosa, glucosa). Es deixa 20 minuts a temperatura ambient perquè els sucres difonguin. S'incuba de 24 a 48 hores a 30 ºC. Es mira el creixement al voltant del disc i els que hagin crescut al voltant, utilitzen aquell sucre i si no l'utilitza no hi creix.

6.2. Bacteris Anaerobis

Gram / Cultiu / Antibiograma: s'ha de fer sense $O_2$. S'ha de vigilar des de la recollida de la mostra. Els medis de cultiu s'han d'embra ràpidament. Els medis mínims a sembrar són: ASA, Ana-broc, a selectiu amb amicacina, a calamicina que permet el creixement d'anaerobis. s'han d'incubar en gerres d'anaerobiosi o en sobres i es posa a incubar i no s'obre fins a les 48 hores. Com són de creixement lent, es fan dues plaques, una per obrir a les 48 hores i una altra per a la setmana. També es poden fer sembres en tubs d'agar, ja que en el fons hi ha condicions d'anaerobiosi.

6.3. Micobacteris (Mycobacterium tuberculosis o bacil de Koch; M. leprae o bacil de Hansen)

Primer es fa un examen directe, després un cultiu i finalment s'identifica. Es fa un estudi de la sensibilitat a tuberculestàtics (per M. tuberculosis). Es pot fer un estudi directe microscòpic amb la tinció de Ziehl-Neelsen. Tenen un creixement molt lent, de setmanes. Es sol treballar amb mostres d'sput o broncoaspirats, però poden estar en tots els fluids. Quan s'obté la mostra cal eliminar els bacteris ja que tenen un creixement més ràpid. S'han de fer en laboratoris especials, ja que no són exàmens de rutina.