Medio de cultivo liá

--__--

Son sistemas generalmente comercializados en forma de cápsulas cerradas en cuyo interior hay esporas de resistencia a la esterilización conocida.-.-.Dichas ampollas, tras haber sido sometidas a condiciones de esterilización, se incuban 56 °C (en caso de cápsulas con Bacillus stearathermophilus) o a 40 °C (en caso de cápsulas con Bacillus subtilis)..--..Al cabo de 24-48 horas, se procede a su lectura donde la germinación y cambio de color indicará en cada caso que no se han producido condiciones de esterilización..--..Uno de los sistemas biológicos, más utilizado, consiste en un vial de polipropileno, en cuyo interior se encuentra un filtro de de papel hidrófobo, con esporas desecadas, una ampolla de vidrio que contiene un medio de cultivo líquido, con un indicador de pH (púrpura de bromocresol)..--..El sistema se somete a esterilización, según protocolo de laboratorio, y en el lugar donde es más difícil llegar el vapor. Una vez realizado el proceso, se rompe la ampolla de vidrio, con lo cual conseguimos poner en contacto las esporas con el medio; y lo ponemos a incubar, al cabo de 24h observamos resultados:El medio inicialmente presenta un color violeta, la esterilización es correcta si se mantiene el mismo color que al comienzo.

5-LIMPIEZA DEL MATERIAL:

Distinguiremos dos tipos de material, según su peligrosidad:

MATERIAL DE ESCASO RIESGO:

Es aquel que no contacta con ninguna fuente de microorganismos.El que no ha estado en contacto con ningún tipo de muestra

.1.-

Se lavará tras su utilización con agua y jabón, con ayuda de estropajos y/o escobillones.

2.-

Se enjuagara con agua corriente varias veces, hasta eliminar todo el jabón.

3.-

Se realiza el último enjuague con agua destilada.

4.-

Se deja secar al aire o se lleva a la estufa Pasteur (50-60ºC). ->se esteriliza o se guarda.

ADVERTENCIA.-

No verter nunca el agar licuado en las tuberías de la red de desagüe, ya que al solidificar la obturarían. Este material, se eliminará siempre como material sólido.

MATERIAL DE ELEVADO RIESGO:

Material que se encuentra potencialmente contaminado con microorganismos,el que ha podido estar en contacto con muestras, por lo tanto es material con riesgo potencial al contagio.Lo primero que necesitamos es esterilizar o desinfectar. De que depende q se desinfecte o se esterilice ? Del tipo de material que sea. ->por una parte se puede desechar y por otra si es reciclable se recicla.(en caso de material de escaso riesgo).

1.- Esterilización post-uso:

Generalmente en autoclave. Si es material que no es susceptible a esterilización y reciclable, se desinfectará (hipoclorito sódico, a ser posible 1h mínimo en inmersión).Las placas petri se colocaran en una bolsa de esterilización y se colocarán en un cestillo ciego, en el autoclave, ya que durante el proceso las placas se derriten, derramando el medio de cultivo.2.-Limpieza propiamente dicha: Igual que el material de escaso riesgo, ya que lo hemos convertido en este tipo de material.

Esterilización pre-uso:

Tras la limpieza todo material de uso aséptico debe esterilizarse de nuevo:__Las pipetas se tapan la boquilla con algodón graso y se envuelven con papel de aluminio, indicando donde se encuentran las puntas para saber por donde deben abrirse, y el tipo de pipeta que contiene, número y la fecha de esterilización o caducidad que será de 3 meses. Esterilizándose en horno Pasteur o autoclave.__Recipientes de vidrio: se tapa la boca con algodón graso , si presentan rosca estará a mitad cerrar y el conjunto o la boca se envuelven con papel de aluminio, identificándolos igual que en el apartado anterior. Se esterilizan en autoclave u horno Pasteur

TEMA 2:CRECIMIENTO BACTERIANO. MEDIOS DE CULTIVOS. Técnicas DE SIEMBRA:

1- INTRODUCCIÓN:

En un ambiente favorable, una célula microbiana aumenta su tamaño y cuando éste se duplica, la célula se divide, generalmente por una bipartición dando lugar a dos células hijas, genéticamente idénticas.-.-.-.El crecimiento de una población de células tiene un ritmo exponencial. La célula bacteriana se divide en dos, cada célula hija se divide a su vez produciendo dos nuevas células, de modo que en cada periodo la población se duplica.

2- FASES DE CRECIMIENTO:

Cuando se inoculan las bacterias en un medio de cultivo líquido, irán creciendo de forma exponencial hasta que el desarrollo celular se vea limitado por algún factor: agotamiento de sustancias nutritivas, acumulación de sustancias tóxicas, descenso del pH, agotamiento del oxígeno....Si representamos gráficamente el logaritmo del número de células viables frente al tiempo obtenemos una curva de crecimiento típica de aspecto sigmoidal, que nos permite diferenciar varias fases de crecimiento:-Fase de latencia o lag-Fase exponencial o log:-Fase estacionaria-Fase de muerte.-.-.-.Parámetro de medida= log N , N= Número de células en el cultivo.T=Tiempo de cultivo

.

1- Fase de latencia

Es el tiempo necesario para la adaptación al nuevo medio donde se siembran. Durante este periodo, los. Microorganismos aumentan su actividad metabólica, se embeben en agua, incrementan la tasa de ARN (esencial para la síntesis de nuevas proteínas bacterianas) y se producen nuevos enzimas. La duración de la fase de latencia depende sobre todo del cultivo previo, de la edad del inóculo, así como de lo apropiado que sea el medio de cultivo.

2- Fase exponencial o logarítmica

Cuando los microorganismos se han adaptado, se inicia esta fase en la que la población bacteriana se duplica de forma importante y el número de células muertas es mínimo. La actividad metabólica en esta fase es máxima, el tamaño medio bacteria no se reduce, las estructuras (pared, membrana, etc.) presentan un espesor mínimo, la sensibilidad a los agentes antimicrobianos es óptima, y las carácterísticas bioquímicas y fisiológicas son más evidentes. .E. Coli: 18 min en el laboratorio- 12 h en nuestro intestino.

3- Fase estacionaria

Es el período durante el cual la tasa de crecimiento disminuye y el número de divisiones es igual al número de muertes, con lo que la población permanece constante..-.-En un recipiente de cultivo cerrado, una población no puede crecer indefinidamente a ritmo exponencial. La limitación del crecimiento se produce o bien porque se agota el suministro de un nutriente esencial o bien porque se acumula algún producto metabólico tóxico

.

4-Fase de muerte

Al volverse las condiciones del medio más adversas cada vez, las bacterias se reproducen más lentamente hasta que cesa y predominan las céluías muertas.
Aparece una fase de declinación exponencial similar, pero en sentido contrario, a lo que sucede en la fase logarítmica.-..-.En la mayor parte de las bacterias, el proceso se desarrolla en 72 horas, de forma que al final de éstas el número de mo viables es muy pequeñño.

TASA DE CRECIMIENTO:

Es el número de generaciones/ hora.

CRECIMIENTO DE UNA COLONIA:

Cuando una población se desarrolla a partir de una única célula en una superficie sólida, forma una masa de células denominada colonia. Las distintas especies de microorganismos forman colonias con diferentes formas y texturas.

3- CULTIVO DE MICROORGANISMOS:

El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones físicas, químicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada.(les proporciona los nutrientes necesarios y el ambiente adecuado para su crecimiento). En general, podemos distinguir cultivos líquidos y sólidos en función de las características del medio y cultivos discontinuos y continuos en función de la disponibilidad de nutrientes en el medio.

4- MEDIOS DE CULTIVO:

Para que una bacteria pueda vivir y reproducirse debe disponer de los nutrientes necesarios, en conjunto de esto origina el medio de cultivo.-.-.Los nutrientes necesarios para el crecimiento varían ampliamente entre los microorganismos. Hay algunos que para su crecimiento solamente requiere los nutrientes básicos.-.-.Un medio de cultivo debe aportar a la bacteria todos los nutrientes necesarios para la síntesis de sus componentes celulares. Así pues, todo medio de cultivo debe contener:__
Agua__Fuente de carbono: Glucosa, lactosa..__Fuente de nitrógeno: Amoniaco, nitratos…__Iones: Fosfato,sulfato, cloruros..__Otros oligoelementos: Zinc, cobre….-.-.-.La mayoría de bacterias y hongos de interés en patología humana crecen con mayor o menor facilidad en medios de cultivo artificiales. Hay, sin embargo, algunas bacterias cuyo cultivo sólo es posible en presencia de células vivas (Rickettsias) otras, cuyo cultivo no se ha conseguido aún (M. leprae: agente etiológico de lepra)..-.-.-.Hay bacterias que son incapaces de sintetizar algunos de los metabolitos esenciales para su crecimiento, por lo tanto es necesario añadirlos al medio. Se definen como factores de crecimiento y son:__Vitaminas: actúan como coenzimas__Aminoacidos: precursores de las proteinas__Bases púúricas y pirimidinicas: precursoras de los ácidos nucleicos__Otros: como los factores V y X, presentes en la sangre.

CULTIVO PURO O Arsénico

Para el estudio de un microorganismo en el laboratorio es necesario aislarlo, ya que se encuentran generalmente en comunidades mas o menos complejas, así, denominamos cultivo puro, a aquel en el que solo ha crecido un tipo de MO

5-COMPOSICIÓN DE LOS MEDIOS: Los constituyentes más utilizados en losmedios son

:__Agar:

Se presenta en gránulos o polvo.Sust q se utiliza en los medios de cultivo para solidificarlos.Especie de gelatina

.__Peptona:

Producto de composición variable, obtenido mediante hidrólisis a partir de proteínas animales o vegetales, por ejemplo.- hígado, músculo, sangre, leche…

__Carne:

El corazón de buey, el músculo y el hígado son utilizados frecuentemente, también se utilizan cerebro, placenta o el bazo de ternera

.__Extracto de carne:

Contiene bases orgánicas solubles, productos de degradación de las proteínas, vitaminas y minerales

.__Extracto de levadura:

Se consigue a partir de levadura de pan o de cerveza y es una fuente rica en Aa y vitaminas

.__Sangre:

Debe de estar libre de agentes antimicribianos, para no inhibir el crecimiento. La más utilizada es la de carnero y caballo

.__Bilis:

Contiene varios ácidos biliares y pigmentos como bilirrubina

.__Sales biliares:

Son extraídas de la bilis, inhiben el crecimiento de G(+)

.__Carbohidratos:

Se utilizan para enriquecer los medios, promover el crecimiento o la pigmentación y determinar la producción de ácido y/o gas

.__Indicadores:

Se incorporan a los medios para dar prueba visual del pH y otros cambios producidos durante el crecimiento.

6.-CONDICIONES AMBIENTALES IDÓNEAS PARA SU CULTIVO:

Incluso cuando se hallan presentes todas las sustancias nutritivas requeridas, el crecimiento y desarrollo de los microorganismos depende de determinadas condiciones del medio para vivir:

1-Temperatura:

Cada especie bacteriana tiene una temperatura óptima para el crecimiento. En función de esta temperatura óptima las bacterias se clasifican en:__Mesófilas: la temperatura óptima oscila entre 20 y 45º__Psicrófilas: la temperatura óptima está por debajo de los 20ºC__Termófilas: su crecimiento es óptimo a temperaturas comprendidas entre 55 y 80ºC.

2-PH:

El pH óptimo para el crecimiento bacteriano depende de la especie, pero cada una de ellas crece en un intervalo relativamente estrecho, normalmente próximo a la neutralidad. Para disminuir los cambios de pH, en medios definidos se suele utilizar sistemas amortiguadores.-.-.Para regular el pH óptimo de un medio, utilizaremos un ácido si lo que nos interesa es disminuir el pH, y por el contrario una base, si lo que interesa es aumentarlo.

3-Presión osmótica:

generalmente se suelen cultivar en condiciones de isotonía, pero hay algunas que pueden crecer a concentraciones más altas, son las denominadas halófilas u osmófilas.

4-Presencia de oxígeno

Todas las bacterias aerobias obligadas necesitan oxígeno como aceptor final de electrones. En los medios de cultivo líquidos, estas bacterias solo crecen en la superficie, ya que a medida que se desciende hacia el fondo del recipiente la concentración de oxigeno va disminuyendo.-.-.-.Por el contrario, en el caso de bacterias anaerobias estrictas, el oxigeno atmosférico ha de excluirse del medio, pues resulta tóxico para ellas. Esto se consigue utilizando frascos en los que se ha hecho el vacío, medios que absorban el oxigeno o medios reductores (tioglicolato, cisteína).

Según el último aceptor de electrones, las bacterias se dividen en:

AEROBIAS:el último aceptor de electrones es el oxígeno.Necesitan obligatopriamente oxigeno para vivir.

ANAEROBIAS:

el último aceptor de e- es una molécula diferente al oxígeno.El O2 es letal, ausencia de O2.

ANAEROBIAS FACULTATIVAS:

pueden utilizar tanto el oxígeno como otra molécula.No importa si hay O2 o no.

5-Presencia de CO2

Todas las bacterias requieren la presencia de pequeñas cantidades de dióxido de carbono para su crecimiento, que normalmente proviene de la atmósfera o de reacciones de oxidación fermentación de la propia célula. Sin embargo, existen otras bacterias, como Brucel/a, que requieren concentraciones mayores de este compuesto, entre el 5 y el 10%, en este caso debe ser suministrado al medio de incubación.

Microaerolofilas:

las que necesitan una concentración determinada de CO2 para vivir.

6-Hidratación

Las bacterias están constituidas por una elevada proporción de agua (80%) y precisan además, un ambiente húmedo para su desarrollo.La desecación es letal para muchos microorganismos. Las bacterias esporuladas son las únicas que pueden sobreviven en ambientes secos durante largos períodos de tiempo.

7- CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS:

Los medios de cultivo se pueden clasificar según:

1.Su composicióon:

-Naturales:

Están constituidos por sustancias naturales.- patata, extracto de carne…

-Sintéticos:

En su composición aparecen sustancias químicas definidas.

-Semisintéticos:

En su composición aparecen moléculas naturales hidrolizadas2.Su consistencia:

- Líquidos:

Los nutrientes se encuentran disueltos en una solución,.,acuosa. Se denominan caldos. Ejem: Caldo cerebro-corazóon.Se utilizan para favorecer el crecimiento de microorganismo s que se encuentren en pequeña cantidad, para el estudio del tipo respiratorio y de la sensibilidad a los agentes antimicrobianos.

-Sólidos:

Son medios líquidos a los que se añade una sustancia solidificante. La mas ampliamente utilizada es el agar. Se añaden 15-20 g/l. Ejem: Agar sangre, agar chocolate, etc.-.-.En los medios sólidos los microorganismos crecen formando colonias(poblaciones bacterianas que surgen de un único microorganismo.), cuyas carácterísticas morfológicas son importantes para su identificación.

-Semisóolidos:

Son medios líquidos a los que se añade una cantidad de agar mas baja que a los medios sóolidos. Suele aññadirse 5-10 g/l..-.Se utilizan para conocer la movilidad de los microorganismos. .

3.-Su aplicación:

- Medios ordinarios o generales:

Son medios que en su composición sólo tienen los componentes básicos, sin ningún factor de crecimiento adicional. Ejem: Agar nutritivo.Se utilizan cuando en el producto patológico a sembrar se sospechan gérmenes sin exigencias nutritivas especiales. Ejem: Enterobacterias, Pseudomonas, etc.-.Sin embargo, son numerosas las especies bacterianas que sembradas en medios ordinarios no crecen o proliferan tan pobremente que su aislamiento e identificación resulta difícil o imposible.

-Medios enriquecidos:

Son medios ordinarios a los que se añaden ciertas sustancias (suero. Sangre, V1t. K. Extracto de levaduras. Etc.) que aportan los factores de crecimiento necesarios para el cultivo de determinados microorganismos( N. Meningitidis. S. pneumoniae,H. Injluenzae, etc.).

Ejemplos de medios enriquecidos:__

Agar sangre: agar normal al que se le añade sangre__Agar chocolate: agar normal al q se le añade sangre hemolizada.__Caldo tioglicolaro medio liquido general al que se le añade triglicolaro.-.-.En estos medios crecen no sólo los gérmenes exigentes para cuyas necesidades se ha ideado el medio, sino también, los gérmenes menos exigentes que crecerían en medios ordinarios. Así pues, en ellos crecen la mayor parte de bacterias y hongos que pueden encontrarse en un producto patolóogico.

-Medios diferenciales o de aislamiento:

Son medios que en su composición contienen sustancias e indicadores que permiten diferenciar unos microorganismos de otros, basándose en sus propiedades metabólicas..-.-..Un medio muy utilizado en microbiología clínica es el medio de Mac Conkey que contiene, entre otras sustancias, Lactosa y un Indicador de pH. Si la bacteria al proliferar metaboliza la lactosa produce ácido que se pone de manifiesto por el viraje del indicador. Así en este medio las colonias de mientras que las colonias de Salmonella, que no utilizan la lactosa, no toman color.

- Medios selectivos e inhibidores:

Son medios sólidos que contienen sustancias (colorantes, antibióticos. Sales biliares, etc.) que inhiben el crecimiento de algunos microorganismos, ademas de contener las mismas sustancias que los medios diferenciales.Así seguún los inhibidores presentes se seleccionarán unas u otras especies.

Ejemplos:__

Agar MacConkey: Contiene sales biliares y cristal violeta que inhibe el crecimiento de las bacterias Gram +.__Agar Sangre CNA: Contiene Colistina y Ac. Nalidixico para inhibir los gérmenes Gram-.

-Medios especiales:

Se utilizan para el desarrollo de lo una determinada especie cuando el médico solicita específicamente.

Ejemplos:__

Lowenstein-Jensen para el aislamiento de M tuberculosis.__Bordet-Gengou para el aislamiento de B. Pertusis.

-Medios de transporte y mantenimiento:

Se utilizan en la recogida,transporte y conservación demuestras biológicas. Esencialmente, son medios no nutrientes, semisólidos muy reductores, que inhiben las reacciones enzimáticas autodestructivas dentro de las células y evitan los efectos letales de la oxidación. No deben potenciar el crecimiento.-.-.-.-.Muchos de los medios de cultivo utilizados en microbiología clínica cumplen mas de un cometido. Muchos son selectivos y diferenciales (A. Mc Conkey, A. SS , etc.), enriquecidos, selectivos y diferenciales (A. Sangre CNA),etc .

8-Selección DE MEDIOS PARA EL CULTIVO DE UNA MUESTRA:

Cuando vayamos a realizar un cultivo de un producto patológico seleccionaremos los medios mas adecuados para el aislamiento de los posibles agentes patógenos implicados en el proceso.

Los medios a utilizar estarán en función de:

__Tipo de proceso patológico.__Sospecha clínica.__Tipo de muestra.__Resultados del examen en fresco y/o tinción