Mecanismos de Activación y Maduración de Linfocitos T y B: Presentación Antigénica y Respuesta Inmune

Presentación Antigénica

Presentación por el MHC II

Células dendríticas: Junto con los macrófagos, se encuentran en puntos de acceso a antígenos (Ag). Permanecen inmaduras hasta que digieren el patógeno mediante fagolisosomas y presentan péptidos en la membrana.

Mecanismos de ingestión

• Fagocitosis: Implica la ocupación de receptores de la superficie celular (por ejemplo, Fc) de la membrana plasmática, en zonas conocidas como depresiones revestidas de clatrina.
  Proceso: Ocupación del receptor, fagocitosis dependiente de actina, internalización de receptores para formar fagosomas o vesículas endocíticas.
• Macropinocitosis: Se toman grandes cantidades de moléculas solubles del medio extracelular, formando fagosomas. No requiere la ocupación de receptores asociados a clatrina.

Presentación por el MHC I

Algunos patógenos evitan los fagocitos y penetran en la célula. En este caso, no hay presentación a los linfocitos. La proteína TAP permite que los péptidos sean cargados en moléculas MHC I, formándose el pMHC I. El pMHC I pasa al Complejo de Golgi, y ahí es introducido en una vesícula de transporte exocítico. Finalmente, se queda anclado en la superficie celular para su reconocimiento por los Linfocitos Tc CD8+. Las moléculas MHC I no hacen distinción entre péptidos propios y extraños.

¿Cómo se evita la autorreactividad?

Se consigue mediante la eliminación de la mayor parte de linfocitos T CD8+ autorreactivos.

Activación de los Linfocitos T

Los linfocitos T dirigen la respuesta inmune adaptativa.

Sinapsis inmunológica

Zona de interacción entre la célula presentadora de antígeno (CPA) y el linfocito virgen.
Inicio: reconocimiento del pMHC por el TCR. La unión es estabilizada por la interacción con moléculas CD: CD4, CD8.
La formación del complejo pMHC:TCR:CD(4/8) = PRIMERA SEÑAL de activación.
Se transmite esta primera señal a través del CD3, pero se requiere una segunda señal.

Segunda señal

Moléculas coestimuladoras de la CPA, como el CD3 o CD247, que es fosforilado por LcK e inicia una cascada intracelular.

Transducción de señales en linfocitos T

La sinapsis inmunológica estabiliza la interacción entre el linfocito T y la CPA. Las colas citoplasmáticas de las moléculas CD3 contienen Motivos del inmunorreceptor basados en tirosina (ITAM). Estos inician una cascada de señalización cuando están muy cerca unos de otros, provocando la transcripción de genes específicos.

Maduración de los linfocitos T CD4+

Se produce tras la Sensibilización: Encuentro inicial (preactivación) de los linfocitos T con el antígeno.
Activación: Los linfocitos T vírgenes precursores de Th (Thp) son estimulados para secretar citocinas y expresar receptores de citocinas en la superficie celular. Se convierten en Th0, no comprometidos a una vía. Pueden madurar por las dos vías posibles: Th1 y Th2. Esto depende de las señales que reciba el Th0 en contacto con la CPA.

VÍA 1: Th1

En presencia de LPS de origen microbiano, las CPA secretan IL-12 y otras citocinas. Las T CD4+ responden a estas señales induciendo la incorporación y la activación de células fagocíticas o la activación de linfocitos T citotóxicos = Th1.

VÍA 2: Th2

En otros casos, la presencia de IL-4 puede hacer que los Th0 sigan la vía Th2. Promoviendo la diferenciación de los linfocitos B en células plasmáticas secretoras de anticuerpos o de memoria, mediante la secreción de citocinas.

Maduración de los linfocitos T CD8+

Cuando los linfocitos T CD8+ vírgenes reconocen pMHC I (primera señal) presentado en la superficie de la célula CPA o de otra célula infectada, expresan receptores IL-2.
Segunda señal: La producción de IL-2 por parte de los T CD4+ es estimulada por la presentación de antígeno vía pMHC II en las CPA. La interacción CPA-Linfocito CD4+ aumenta la expresión de CD80/86 de la CPA. Esto promueve la diferenciación del linfocito T CD8+ o citotóxico.

Maduración de los linfocitos T de memoria

La ocupación del TCR con el pMHC II apropiado (primera señal) y la ocupación del CD28 con CD80/86 (segunda señal) estimula la producción de IL-2 y la expresión de receptores IL-2 por los linfocitos T CD4+, así como su proliferación. Algunos CD4+ entran en el estadio de memoria.

Activación de los Linfocitos B

Los BCR reconocen epítopos presentes en las moléculas de la superficie celular o de forma soluble. El complejo BCR de los linfocitos B maduros contiene monómeros de Ig unidos a la membrana asociados a moléculas Ig α e Igβ. De forma similar a CD3, las colas citoplasmáticas de Ig α e Igβ contienen ITAM.
El entrecruzamiento de los BCR inicia la señalización intracelular. Estimula tirosinas cinasas que fosforilan los ITAM de la Ig α e Igβ, permitiendo la incorporación de Syk y la activación de la fosfolipasa C-γ. Esto provoca una cascada de transducción de señales y la activación de factores de transcripción.
La ocupación del BCR: Promueve la endocitosis, la degradación enzimática, la presentación de fragmentos peptídicos como parte del pMHC II y la expresión de moléculas coestimuladoras. Permite que el linfocito B actúe como una CPA para que el TCR de los linfocitos T CD4+ puedan reconocer los péptidos que presenta.

Activación T-independiente

Antígenos T-independientes (TI)= activan al linfocito B sin la cooperación de los linfocitos T.
Hay dos grupos:

TI 1

Son activadores policlonales (origen microbiano) que se unen a estructuras de la superficie celular diferentes al BCR. Activan al linfocito B independientemente de la especificidad del BCR por el epítopo.
En altas concentraciones: Estimulan la activación y proliferación de linfocitos B y aumentan su producción y secreción de Ig. = mitógenos de linfocitos B.
En bajas concentraciones: Estimulan los linfocitos T específicos de antígeno.

TI 2

Contienen epítopos repetidos, se unen a BCR y provocan entrecruzamiento. Sólo activan linfocitos B maduros (los TI 1 también inmaduros). El acercamiento de las colas citoplasmáticas de Ig α e Igβ origina el inicio de una cascada de transducción de señales. A veces, se proporciona una segunda señal T-independiente al complejo correceptor del linfocito B junto con los componentes del complemento. El C3d o C3b se unen a un antígeno unido al BCR, y pueden ser reconocidos por el CD21 o el CD35 respectivamente. Las moléculas CD19 y CD81 se asocian a la membrana celular para formar el complejo correceptor del linfocito B (CD21:CD19:CD81). Varias tirosinas cinasas fosforilan las colas citoplasmáticas de CD19 y activan la cascada de transducción de señales.

Activación T-dependiente

En la mayor parte de las ocasiones, las segundas señales son proporcionadas por los linfocitos T CD4+. La ocupación del TCR en el linfocito T CD4+ da lugar a la presentación del pMHC II por un linfocito B o CPA (primera señal). La coestimulación a través del CD28:CD80/86 y/o CD40:CD154 proporciona una segunda señal al linfocito T estimulando la producción de IL-4. Esto hace que el linfocito prolifere y, en presencia de otras citocinas producidas por los linfocitos T, se diferencie hacia una célula plasmática secretora de anticuerpos.

Células plasmáticas y linfocitos B de memoria

No todos los linfocitos B se diferencian hacia células plasmáticas. Algunos linfocitos B estimulados se convierten en células B de memoria.

Cuantificación de Inmunoglobulinas Séricas

Existen dos métodos basados en la formación de inmunocomplejos. Cuantificamos la Ig (antígeno) con anticuerpos (Ac) de otra especie. Se puede cuantificar IgA e IgG, pero IgD e IgE no son detectables.

Nefelometría cinética

Se basa en la dispersión de la luz por el inmunocomplejo.

Inmunodifusión radial simple

Se basa en la precipitación del inmunocomplejo en un gel de agarosa. Se fundamenta en la difusión del antígeno (Ag) en un gel que contiene anticuerpos específicos para la proteína que queremos cuantificar. Precipitan en un anillo dependiendo de la concentración de Ag y Ac. El tamaño del anillo aumenta hasta que llega al equilibrio, y luego disminuye. Midiendo los diámetros, comparando con los parámetros del fabricante, extrapolamos y obtenemos la concentración de Ig séricas. Utilizamos el método de difusión a tiempo final cuando ha terminado y comparamos con el fabricante. También hay dos métodos más (uno construyendo una recta de calibración con diferentes fases: Ag>Ig, Ag=Ig y AgProcedimiento: Se pone en los pocillos el suero, se incuba a temperatura ambiente garantizando la humedad para que no se seque. Para cada diámetro, con la tabla obtenemos IgG, IgM e IgA en la muestra según el Ac usado en el gel. El de mayor diámetro indica que tiene más inmunocomplejos.
IgA elevados: posible enfermedad crónica del hígado y mieloma.
IgA bajos: déficit proteico o inmunodeficiencia.
IgG reducido: déficit proteico o inmunodeficiencia de IgA.

Función Linfocitaria

Evaluamos la capacidad de respuesta de los linfocitos midiendo la proliferación cuando son estimulados por mitógenos (inducen la mitosis y entran en fase G1). Son las lectinas, anticuerpos monoclonales, interleucinas, ésteres de forbol e ionóforos de calcio.
Procedimiento: aislar los linfocitos e incubar con mitógenos. Utilizamos lectinas (PHA, fitohemaglutinina) que solo estimula a los linfocitos T. La máxima estimulación se produce a las 72 h. Aislamos por centrifugación sobre una solución de densidad definida (ficoll), se hunden los hematíes y granulocitos, y flotan los linfocitos y monocitos. Teñimos con azul tripán (solo tiñe de azul las células muertas). Realizamos un recuento celular (antes y después de incubar). Incubamos con precaución de que no falte medio de cultivo para asegurar la división.

1. A la sangre heparinizada se añade ficoll, se centrifuga (banda blanca de plasma y plaquetas, nube blanca de linfocitos y monocitos, transparente de ficoll, roja de eritrocitos y granulocitos).
2. Se retira la nube con cuidado (retirar lo máximo posible), añadir RPMI y centrifugar.
3. Quitar el medio de lavado y resuspender con 1 ml de RPMI, centrifugar. Repetir.
4. Ajustar la concentración, teñir con tripán, incubar y realizar el recuento.
5. 1 Método de cámara Neubauer: podemos diferenciar vivos y muertos.
6. 2 Método de contador Scepter (número real de linfocitos), no diferencia vivos y muertos.
7. Incubamos.
8. 1 Volvemos a realizar el recuento. Y obtenemos el índice de proliferación y blastogénesis.

Resultados: Se pueden confirmar o descartar inmunodeficiencias congénitas y secundarias, y la acción de terapias inmunomoduladoras.

Cuantificación de Linfocitos T Mediante la Formación de Rosetas

Importante para evaluar a pacientes con deficiencias innatas y adquiridas, en tratamientos con inmunosupresores en leucemias linfocíticas o VIH (CD4). Para cuantificar los linfocitos T hacemos que se unan a eritrocitos ovinos formando agrupaciones (rosetas) mediante la unión con el CD2 del linfocito T maduro con el LTA-3 en el eritrocito. Sustituido por inmunofluorescencia con Ac monoclonales. La unión Linfocito T-eritrocito es frágil, se puede aumentar la afinidad agregando muchas proteínas (suero fetal bovino), pero hay que tener cuidado con las agitaciones. Las rosetas las forman los linfocitos T vivos o activos, los muertos (teñidos por el tripán) no se cuentan.
Procedimiento: Obtener los linfocitos por centrifugación con ficoll como en la práctica 1. Mezclamos con eritrocitos y suero fetal, centrifugamos y refrigeramos. Teñimos con tripán. Miramos por Neubauer.

Fagocitosis

Método 1

Observación directa de células fagocíticas activas

Evaluamos la capacidad de los fagocitos para ingerir bacterias. Cogemos una colonia de Salmonella, la juntamos con sangre heparinizada e incubamos. Después, realizamos una tinción de Wright (metanol, eosina y azul de policromo). Mirar por microscopio y ver cuántas células han fagocitado. Los que han digerido presentan bacterias teñidas en su interior, de forma irregular e inflados.

Método 2

Reducción del NBT

Evaluamos la capacidad microbicida mediante el estallido respiratorio (metabolismo de producción de especies reactivas). El NBT es un compuesto soluble amarillo que, al ser fagocitado y reducido por las especies reactivas, forma cristales de formazán (morados). En enfermedades con deficiencia innata de los fagocitos (defecto de la oxidasa NADPH, como la enfermedad granulomatosa crónica) no se producen especies reactivas, y esto es lo que evaluamos.
Procedimiento: Mezclamos suero con NBT y un estimulante de la fagocitosis (LPS de E. coli) y teñimos con Wright.
Resultados: Si hay pocos fagocitos con cristales de formazán, indica que hay poco estallido respiratorio asociado con una baja producción de especies reactivas, lo que puede indicar una enfermedad con deficiencia innata de los fagocitos. Una contaminación puede aumentar la fagocitosis.

Cuantificación de la Proteína C Reactiva

Para ver si está asociada a una patología hepática. Es producida por el hígado. Si aumenta (por aumento de IL-6) puede indicar un fallo hepático: estar asociada a infecciones, lesiones de tejido, inflamaciones o neoplasias malignas. Activa el complemento (vía clásica). Usamos el test PCR, que contiene anticuerpos PCR que provocan la aglutinación (inmunocomplejo) de la PCR del suero problema. Se realiza una prueba cualitativa y cuantitativa.

Diagnóstico de Brucelosis

Método 1

Rosa de Bengala

Prueba cualitativa de cribado, diagnóstico temprano. Detecta anticuerpos de Brucella en sangre. Se utiliza un antígeno de Brucella abortus que detecta aglutininas específicas de Brucella. Si la muestra es positiva, se forma un inmunocomplejo y precipita.

Método 2

ELISA

Determina cuantitativamente la presencia de anticuerpos frente a antígenos de Brucella. Para ello se usa una enzima (peroxidasa y fosfatasa alcalina) que colorea según la cantidad de inmunocomplejo formado (Ac en suero).
Puntos clave: especificidad del antígeno (Ag) con el anticuerpo (Ac). Capacidad de unir covalentemente enzimas al Ac sin afectar la especificidad ni inhibir la enzima.

ELISA Indirecto

Técnica semicuantitativa. Se usa Ag LPS de Brucella pegado a una placa, se añade suero y, si contiene Ac, se forma el inmunocomplejo. Se lava y se añade una enzima en un soporte de Ac monoclonal IgG porcina que se une a los posibles Ac existentes en el suero, se lava. Se añade el sustrato de la enzima para que dé tonalidad. Si hay color, la reacción es positiva, y la tonalidad es proporcional a la cantidad de Ac en el suero.

ELISA de Bloqueo

Se usa Ag LPS de Brucella pegado a una placa, se añade suero y, si contiene Ac, se forma el inmunocomplejo. Se lava y se añade una enzima en un soporte de Ac monoclonal anti LPS de Brucella. Este Ac se añade a epítopos LPS de no haberse producido la formación de inmunocomplejos, o viceversa. Añadimos el sustrato de la enzima para ver si hay tonalidad (si hay presencia de enzima o no) indicando la presencia de Ac.