Marcaje de Sondas en Técnicas de Hibridación: Métodos y Aplicaciones
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El marcaje de las sondas
Las sondas empleadas en técnicas de hibridación deben estar marcadas para poder detectar el híbrido formado con la secuencia diana.
El marcaje es el procedimiento de etiquetar la sonda utilizada en las técnicas de hibridación con la finalidad de poder visualizar los resultados.
El procedimiento para el marcaje de sondas dependerá del tipo de marcador que se utilice.
Clasificación de los marcadores
El tipo de marcador utilizado condiciona el método de detección del híbrido. Podemos clasificar los marcadores según permitan o no la detección directa del híbrido:
- Marcadores de detección directa: Incluyen los isótopos radiactivos y los fluorocromos.
- Marcadores de detección indirecta: Requieren métodos de revelado en varios pasos, como es el caso de los haptenos.
Isótopos radiactivos
Son elementos químicos con capacidad de emitir radiaciones. Los más utilizados son el fósforo-32 y el tritio.
Los isótopos radiactivos se utilizan principalmente en técnicas de hibridación en filtro, como son Southern blot, Northern blot y Dot blot.
La detección del híbrido se realiza revelando el marcaje radiactivo mediante autorradiografía con una película de rayos X.
Fluorocromos
Son compuestos químicos que emiten luz al ser excitados por la luz ultravioleta. Tradicionalmente, se han utilizado derivados de la fluoresceína y la rodamina.
Las sondas marcadas con fluorocromos se utilizan principalmente en la técnica FISH (hibridación in situ fluorescente). El empleo de varias sondas marcadas con diferentes fluorocromos permite detectar simultáneamente varias secuencias diana.
Para la detección del híbrido marcado se requiere un microscopio de fluorescencia.
Haptenos
Son moléculas de pequeño tamaño que, al igual que los fluorocromos, se pueden acoplar a los nucleótidos y no alteran la especificidad de la sonda. Sin embargo, a diferencia de los fluorocromos, no pueden ser detectados directamente; por tanto, la detección del híbrido requiere métodos indirectos de revelado basados en la afinidad química de moléculas o en métodos inmunológicos.
Los haptenos más utilizados son la digoxigenina y la biotina.