Insulina (Diabetes)

CLONACION DEL DNA

• Clon : Población de células descendientes todas ellas de una misma célula inicial.
• Clona (Griego clon= retoño, vástago) : para referirse a la multiplicación de una planta podada y plantado de sus ramas para obtener plantas hijas idénticas (genéticamente)  a la madre.    
• Clonación molecular del DNA:                 Inserción  de un segmento de ADN extraño, de una  determinada  longitud, dentro de un vector que se replica en un huèsped específico. 
•        Implica la manipulación dirigida del material genético por recombinación del DNA in vitro, y su multiplicación dentro de una célula hospedera donde se sintetizan copias idénticas.

• La recombinación in vitro del DNA comprende la purificación de  material genético a partir de cualquier fuente, su manipulación y modifica ción enzimática en tubo de ensayo, su unión química con otras moléculas de DNA, su intro ducción a células hospederas y la selección de aquellas células que adquirieron  el DNA

 Clonamiento posicional :  (Aplic.) Técnica para identificar genes, basada en su localización dentro de un cromosoma. Técnica asociada con la  detección de riesgo  a enfermedades genéticas.

• ENDONUCLEASAS  DE  RESTRICCION
• Definición: Son proteínas multiméricas que protegen a los organismos contra la invasión de DNAs extraños,  a los que modifica a cor ta/restringe. Se conoce tres grupos de estas enzimas de restricción : tipo I, tipo II y III
• Las endonucleasas de restricción tipo II son las verdaderas tijeras moleculares por que reconocen y cortan los mismos pares de base que son secuencias palindrómicas de 4 a 6 pb.
• Al cortar puede dejar o no  algunos nucléótidos sin aparear alo que se le denomina extremos salientes, en caso contrario, extr. Rasurados

• Preparando ADN Recombinante

• Ejemplos :

Ava I ^5’C’ Py C G Pu G         SacII ^5’C C G C’G G

                                G Pu G C Py’ C^5’                                                      G G’C G C C^5’

Ava II  ^5’G G (A/T) C C         SmaI ^5’C C C ‘G G G

                                  C C (T/A) G G^5’                                   G G G ‘C C C^5’

Ava III ^5’A T G C A T              XmaI ^5’C’C C G G G

                                 T A C G T A^5’                           G G G C C’C^5’

EcoRI ^5’G’A A T T C               HaeIII ^5’G G’C C

                                 C T T A A’G^5’                           C C’G G^5’

• ISOESQUIZÓMEROS: Enzimas aisladas de diferentes géneros pero reconocen y cortan la misma secuencia de DNA.

Se denomina isoesquizómeros imperfectos a las ER que reconocen las mismas secuencias y cortan en distintas posiciones.

NOMENCLATURA:

La 1ª letra del género del que se aisló y las dos 1ras. Letras de la especie en letras itá licas.

La letra del nombre de la cepa de origen.

En número romanos el orden de descubri miento.

• Las ER fueron clave para el manejo del DNA, ya que siempre reconocen la misma secuencia en las mismas condiciones de reacción. Esto per- mite construír mapas, ubicar genes, generar fragmentos con extremos conocidos facilitando su manejo, caracterización y clonación de los mismos.

Los fragmentos obtenidos pueden separarse por electroforesis en gel, donde estos f. migran a velocidades diferentes que va a depender de su tamaño y carga eléctrica neta.

Luego pueden unirse enzimáticamente con DNA ligasa (Bacteriófago T4 o E. coli)

• MAPA DE RESTRICCIÓN

Es un diagrama que muestra la distribución lineal de los sitios de corte de las enzimas

De restricción en un fragmento de DNA. Constituyen una herramienta para caracte rizar DNA y detectar en él cambios natura les o inducidos experimentalmente en el DNA.

Es un mapa físico, generado por digestión del fragmento de DNA con distintas enzimas de restrición y midiendo los fragmento resul  tantes

• La CLONACION del DNA comprende:
• La purificación del material genético a partir de cualquiera fuente (síntesis química o enzi mática, cromosomas, virus, mitocondrias, etc.)
• Su manipulación y modificación enzimática en un tubo de ensayo, esto es su unión química con otras moléculas de DNA (DNA vector que permita continuar su manipulación de manera segura y estable).
• Su introducción en células hospederas (E.coli, Bacillus subtilis, S. cerevisae, hongos, células de insectos y de mamíferos).
• La selección de aquellas células que adquirieron el DNA modificado

• ELEMENTOS DE UN EXPERIMENTO TÍPICO DE CLONACION DE ADN :
  º  El vector o  vehículo molecular (plásmido,            virus, fago) ;
  º  El fragmento de ADN de interés que se   desea clonar (ADN exógeno”o“pasajero”);
  º  Secuencia poliligadora ;
  º  Endonucleasas de restricción;
  º  DNA-ligasa, para sellar fragmentos ;
  º  Una célula huésped ( Echerichia coli  o Agrobacterium sp., o Saccharomyces cere- visiae) para expresar el ADN de interés.
• VECTORES O VEHICULOS MOLECULARES
• Son entidades extracromosomales  circulares con capacidad de replicación autónoma, conocidas como replicones, esta categoría incluye los plásmidos, virus y bacteriófagos.
• Virus y bacteriófagos se utilizan para clonar fragmentos largos de DNA (hasta más de 20 kilo- pares de bases).
• Los plásmidos no poseen infectividad ni cápsula proteica que le permita sobre vivir en latencia fuera de la célula. Están presentes en una gran variedad de organismos procariotas y eucariotas y se identifican con múltiples funciones:  resistencia a antibióticos, metales pesados y radiaciones, //

• Los plásmidos :
• producen bacteriocinas (ciertas endonucleasas) ,
• fijan el Nitrógeno atmosférico ( en ciertas bacterias del suelo),
• desarrollan tumores en plantas , y
•  producen determinantes de virulencia bacteriana .
• Ellos son de tamaño variable (de 1 a 200 kilopares de bases).

• Características básicas de un vector de clonaciòn Eficiente:
•   Un origen de replicación.
•   Genes marcadores para selección       visual.
•   Varios sitios de clonación útiles.
•   Tamaño pequeño que facilite su en    trada a la célula hospedera, y
•   Secuencia nucleotídica   completa       mente conocida.

• Otras características deseables:
• -  Genes para mantenimiento y replicación:
• Para retención , partición y regulación, y orígenes de replicación alternativos.
• Elementos para transcripción: promotores, terminadores, atenuadores y antiterminadores.
• Elementos para traducción: sitio de unión al ribosoma, codón de inicio, codones de término.  Elementos para modificaciones post traduccionales.
• Modificaciones pos-traduccionales
• De las proteínas.
• Modificación de los aminoácidos mediante adiciones como  la de grupos acetilo, car- boxilo,  hidroxilo, fosfato, metilo, N-formi lación.
• Glicosilación.
• Acilación .
• Procesamiento proteolítico (zimógenos)
• Poliproteínas, se cortan alternativamente. (hormonas peptídicas producidas en lóbulo anterior pituitaria)
• Resumen de Características del Vector
• Buena caracterización funcional y total caracterización estructural.
• Tamaño pequeño (eficaz transformación y buena recepción de ADN exógeno o de interés.
• Estabilidad dentro del huésped (no “segregue”).
• Presencia de marcadores de selección visual.
• Presencia de múltiples sitios únicos de restricción dentro de los genes marcadores de selección.
• Capacidad de “amplificar“ el número de copias..

• Formas de generar in-vitro segmentos de ADN :
  • Digestión por endonucleasas de restric ción. Util para obtener poblaciones de  fragmentos con tamaños homogéneos.
  •                Síntesis  enzimática por reacción en cade na  de la polimerasa o por transcripción inversa ( RT )  a partir de  RNAm.
  •    Síntesis química   (de oligonucleótidos).
  •    Rotura mecánica del DNA en condiciones controladas (cizallamiento para obtención de fragmentos largos al azar + de 10 kpb).

• Transcriptasa inversa

Es una DNA-polimerasa que sintetiza una hebra de DNA complementaria a una hebra de RNA o un híbrido DNA-RNA.

Es útil para genes eucarióticos que contie - ne intrones en su DNA genómico.Las colas de PoliAA.. de mRNA maduro se utilizan pa ra hibridar colas poli TT.. Complementarias a la cola anterior y tener un extremo 3’OH para que se sintetice 1º una hebra d’ cDNA y luego un gen DNA de doble hebra, utilizando la Nuclesa S1 y la DNA polimerasa I-

• DNA-LIGASA
• Cataliza la formación de enlaces fosfodiéster entre el grupo 3’ OH de un segmento y el extremo 5’ fosfato del segmento adyacente.
• Factores que afectan la eficiencia de la ligasa :
•      -  El tipo de extremos ( rasurados vs. cohesivos)
•      -  La temperatura, óptima 12ºC para extremos           rasurados y de 12º a 37ºC para extremos            cohesivos.
•      -  Concentración relativa de elementos conforme    a su peso            ( 1 Mol de vector por 1 Mol de                 ADN de interés).
•      -  Concentración de la ligasa.

• TRANSFORMACION O TRANSFECCIÓN Introducción de un vector recombinado en una célula huésped.  Técnica útil en la Ingeniería genética, reúne características de la infección por bacteriófagos y la transformación (incorporación directa de DNA exógeno en el genoma celular modificado).
• TRANSFORMACION
• Paso del DNA recombinado in vitro a través de las membranas de las células  hospederas y su incorporación en la célula como un elemento estable.
• Los factores que determinan la eficiencia de la transformación :
• -  Los que afectan la entrada, y
• -  Los que afectan la persistencia y herencia del material genético después de la entrada.

• Tipos básicos de transformación
• Métodos químicos: utilizan cationes divalentes como Mg, Ca y Mn, además de un choque tèrmico.
• Métodos físicos, como : - i) electro- poración por pulsos cortos de fuertes campos eléctricos; - ii) la microinyección; y iii) la biobalística para células vegetales.
• Métodos biológicos, como : - i) la con- jugación,  y – ii) la transducción.

• Características del proceso.
• Lograr desestabilizar (rotura discreta de la membrana por uso de cationes divalentes (Ca++, Mg++),polianiones (dextrán), infección por virus, microagujas. Microbalística, pulso eléctrico.
• Formación del complejo calcio-fosfato que estimula,  la entrada y estabilización del DNA transforman te.
• CÉLULAS COMPETENTES
• Aquellas capaces de tomar DNA de su ambiente. Ej. Bacillus subtilis, Pneumococcus, competen- tes naturales.
• Mandel y Higa (1970) logran competencia artifi cial de E.coli  ( breve choque tèrmico a células creciendo rápido a 4ºC en solución hipotónica  de Cl₂Ca (Mg++).
• La frecuencia de transformación, es influída por :

     1. Eficiencia de formación de esferoplastos.

     2.Viabilidad celular después de tratar con CaCl₂

     3. Pureza, conformación y concentración del              DNA

• IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS TRANSFORMADAS
•  Se conoce varias maneras, que puede agruparse en dos:
•  Método de identificación indirecto, Consiste en inactivar un gen marcador (resisten cia a antibiótico) que confiere una actividad vital en medio selectivo. Es indispensable hacer doble
•                plateo, uno con medio selectivo y otro no , por- que la presión de selección ocasiona la muerte de las células recombinantes.
• Método directo, requiere un vector que codi fique una función letal (sensibilidad a selenio) o una complementaria ( β-galactosidasa).
• El método de selección directa de recombinantes utiliza como marcadores: genes letales y genes reporteros. En el primer caso sólo los genes interrumpidos por la transformación logran la supervivencia. Este método es muy útil cuando se requiere analizar un elevado número de clonas.En el segundo caso
• Proteínas heterólogas,
• Las que son producto de genes recombinantes (insertados en un vector molecular), que fueron introducidos a una célula huésped que expresa (produce/ fabrica) estas proteínas.
• Genes heterólogos
• Los que no pertenecen al organismo que actúa como hospedero y fabricante de la proteína heteróloga o recombinante.
• Tipos celulares utilizados para producir proteínas heterólogas :
•  E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, Hongos
• (Aspergillus nidulans, Trichoderma reseei), células de insectos (Spodoptera frugiperda, Autographa californica) , células de mamíferos (de tipo hibridoma)
• Proteínas para uso terapéutico que se producen  por DNA٣ (recombinante
• Albúmina sérica (regeneración de proteínas sanguíneas)
• Anticuerpos monoclonales (diagnóstico, cáncer) DNAsa I (Fibrosis quística)
• Factor crecimiento epidérmico (quemaduras)
• Gonadotropina coriónica (Infertilidad femenina)

    Insulina (Diabetes)

• Interleucinas(Cáncer, desórdenes inmunológicos)
•  Vacunas diversas (evitar contagio de enfermedades).