Identificación de Microorganismos en Alimentos y Agua: Medios de Cultivo y Protocolos

1. Medio Baird-Parker (BP) para Staphylococcus aureus

Componentes y Funciones

• Peptona + Extracto de carne: Aportan carbono, nitrógeno y nutrientes esenciales.
• Extracto de levadura: Fuente de vitaminas del complejo B.
• Telurito de potasio + LiCl (Cloruro de Litio): Agentes selectivos que inhiben la flora acompañante.
• Yema de huevo: Permite detectar la actividad de la lecitinasa.
• Piruvato + Glicina: Favorecen el crecimiento de Staphylococcus.
• Agar: Agente solidificante.

Procedimiento (Marcha)

1. Inocular 0,5 mL de la dilución 10⁻¹ en superficie, por duplicado.
2. Incubar a 37 °C durante 48 horas.
3. Realizar el recuento de colonias típicas y atípicas.
4. Seleccionar 5 colonias y transferir a BHI (Infusión Cerebro Corazón).
5. Incubar a 37 °C por 24 horas y realizar la prueba de la COAGULASA.

Interpretación de Colonias

• Típica: Color negro, brillante, de 1 a 2,5 mm de diámetro, rodeada de una zona translúcida con o sin un anillo opaco.
• Atípica: Menos oscura, con zona translúcida pequeña o ausente y sin anillo opaco. Importante: No descartar estas colonias sin pruebas adicionales.
• Coagulasa positiva: Presencia de un coágulo organizado y perceptible; confirma S. aureus coagulasa positivo.

2. Agar Cromogénico para Coliformes (CCA)

El CCA (Chromogenic Coliform Agar) se utiliza para la detección de E. coli y bacterias coliformes en muestras de agua.

Tipo de medio: Selectivo y Diferencial.

Fundamento Bioquímico

• β-D-galactosidasa: Actúa sobre el sustrato Salmon-β-D-galactósido, produciendo colonias de color rosa/rojo (indicativo de coliformes).
• β-D-glucuronidasa: Presente en E. coli, actúa sobre el sustrato X-β-D-glucurónido. Al combinarse con la actividad galactosidasa, las colonias de E. coli se observan de color azul oscuro/violeta.

Componentes Principales

• Peptonas: Fuente de nitrógeno y nutrientes.
• NaCl: Mantiene el equilibrio osmótico.
• Fosfatos: Estabilizadores de pH.
• Piruvato: Fuente de carbono.
• Triptófano: Para la prueba del indol.
• Sorbitol: Carbohidrato fermentable.
• Tergitol-7: Agente selectivo.

Procedimiento y Lectura

Se filtran 100 mL de agua a través de una membrana de 0,45 µm. La membrana se coloca sobre el agar CCA y se incuba a 36 °C por 24 horas.

• Rosa/Rojo: Coliforme presuntivo.
• Azul oscuro/Violeta: E. coli.

Nota: En agua potable, se exige la ausencia de E. coli en 100 mL.

3. Agar Violeta Rojo Bilis Lactosa (VRBL)

Tipo: Selectivo y Diferencial para el recuento de coliformes en alimentos y productos lácteos.

Fundamento

• Sales biliares + Cristal violeta: Inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas.
• Lactosa: Carbohidrato fermentable.
• Rojo neutro: Indicador de pH; vira a rojo en condiciones ácidas.

Técnica de Recuento

Inocular 1 mL de la dilución en placa, añadir aproximadamente 15 mL de VRBL a 45 ± 1 °C. Tras solidificar, añadir una capa superior (overlay) de unos 4 mL del mismo medio. Incubar a 30 ± 1 °C durante 24 ± 2 horas. Contar colonias de color rojo oscuro con un diámetro ≥ 0,5 mm. La capa superior asegura condiciones de anaerobiosis que favorecen la fermentación.

4. Detección de Salmonella spp.

Para el aislamiento, el medio de elección es el Agar Verde Brillante (VB).

Tipo: Altamente selectivo y diferencial.

Procedimiento de Aislamiento

Tras el enriquecimiento selectivo, se realiza una siembra por agotamiento en superficie en el agar VB, incubando a 37 °C por 24 horas.

• Colonias típicas: Rosadas con un halo rojo brillante.

Componentes del Agar VB

• Pluripeptona + Extracto de levadura: Nitrógeno y vitaminas.
• Lactosa + Sacarosa: Azúcares fermentables.
• Rojo fenol: Indicador de pH (vira a amarillo en medio ácido).
• Verde brillante: Inhibidor selectivo.

Secuencia Completa de Análisis

1. Pre-enriquecimiento: Medio no selectivo.
2. Enriquecimiento Selectivo: Caldos TVB y SC.
3. Aislamiento: Agares VB y BS (Bismuto Sulfito).
4. Re-aislamiento: Agar Nutritivo (AN) para obtener colonias puras.

Pruebas Confirmatorias

• Bioquímica: Uso de TSI (Triple Sugar Iron) y LIA (Lysine Iron Agar).
• Serología: Identificación de antígenos específicos.

En el medio BS, las colonias de Salmonella son marrón/negras con brillo metálico. En TSI sospechoso, se observa pico rojo con columna amarilla y/o negra (por H₂S). En LIA, se observa color púrpura en todo el medio, con o sin ennegrecimiento.

Resumen de Parámetros Técnicos

• Agua (E. coli/Pseudomonas): 100 mL | CCA a 36 °C/24 h | CN a 37 °C/48 h.
• Coliformes en Agua (NMP): 10 tubos x 10 mL | CLT a 35-37 °C/24 h | BRILA a 35-37 °C/48 h.
• Baird-Parker (BP): 0,5 mL de 10⁻¹ | Duplicado | 37 °C/48 h.
• VRBL: 1 mL | Overlay | 30 ± 1 °C por 24 ± 2 h.
• Salmonella: VB a 37 °C/24 h | BS a 37 °C/48 h | TSI/LIA a 37 °C/24 h.
• CCA: Membrana 0,45 µm | 100 mL | 36 °C/24 h.