Práctica Nº 23

Aislamiento e Identificación de Bacilos Gram Negativos: Género Brucella

Introducción

Los bacilos del género Brucella son microorganismos pequeños, usualmente cocobacilares, inmóviles y no formadores de esporas. Se caracterizan por ser Gram negativos y requieren una tinción prolongada con fucsina básica (mínimo 2 minutos) en lugar de los 30-60 segundos convencionales de la tinción de Gram.

La enfermedad causada por estas bacterias es conocida como Brucelosis o “Fiebre Malta”. Las especies más relevantes que la provocan son: Brucella melitensis, Brucella suis y Brucella abortus.

Su desarrollo y multiplicación in vitro son lentos, por lo que necesitan medios de cultivo especiales como el Agar Brucella o el Caldo Tripticasa Soya.

Para la identificación de especies, se emplean series bioquímicas que evalúan la producción de H₂S, la hidrólisis de la urea, el desarrollo en medios con fucsina al 0.002 %, tionina al 0.002 % y el requerimiento de CO₂.

Diagnóstico de Laboratorio

Este microorganismo puede ser aislado de diversas muestras biológicas, incluyendo:

• Sangre
• Líquido cefalorraquídeo
• Médula ósea
• Biopsias de ganglios linfáticos
• Biopsias de hígado

I: Hemocultivo

Para el hemocultivo, se utiliza el medio de doble fase (sólido + líquido) de Ruiz-Castañeda. La incubación debe realizarse en una atmósfera con 5-10% de CO₂ a una temperatura de 35-37°C. Las colonias suelen aparecer entre el 4º y 5º día, pero los cultivos deben mantenerse incubados hasta por 30 días antes de ser considerados negativos.

II: Serología

Para el diagnóstico serológico de la brucelosis, se emplean las siguientes técnicas:

1. Aglutinación rápida en placa
2. Aglutinación lenta en tubo (Reacción de Wright)
3. Prueba de aglutinación con 2-mercaptoetanol (2-ME)
4. Prueba modificada de Coombs (antiglobulina)
5. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Material

• Tubo con cepa de Brucella
• Frascos con medio de Ruiz-Castañeda
• Muestra de sangre total de paciente
• Agar fucsina en placa
• Agar tionina en placa
• Suero positivo y suero control negativo
• Antígeno estandarizado de Brucella
• Láminas excavadas
• Pipetas de 0.2 ml
• Palillos mondadientes
• Láminas portaobjetos
• Kit de coloración de Gram

Procedimiento

I: Hemocultivo

Agregar 5 ml de sangre de un paciente con sospecha de brucelosis al medio de Ruiz-Castañeda. Incubar a 37°C durante 4 a 5 días. Es fundamental esperar hasta 30 días para descartar el cultivo.

Coloración de Gram

Realizar un frotis a partir de la cepa desarrollada en Caldo Tripticasa Soya y teñirla mediante el método de Gram, siguiendo las recomendaciones específicas para bacilos Gram negativos.

II: Serología (Reacción de Wright - Aglutinación Lenta en Tubo)

1. En una lámina excavada, colocar una gota (0.01 ml) de suero control negativo en el primer círculo de la segunda línea.
2. En la misma lámina excavada, añadir las siguientes cantidades de suero positivo: 0.08 ml, 0.04 ml, 0.02 ml, 0.01 ml y 0.005 ml, correspondientes a las diluciones esperadas.
3. A cada alícuota de suero, añadir una gota de antígeno estandarizado de Brucella (aproximadamente 0.03 ml).
4. Mezclar cuidadosamente cada muestra por rotación, utilizando un palillo mondadientes. Iniciar la mezcla desde el suero negativo y la dilución más alta (1:400).
5. Dejar reposar la lámina durante 3 minutos. Posteriormente, rotar la lámina suavemente durante 1 minuto y dejar en reposo por 4 minutos adicionales.
6. Observar a los 8 minutos la presencia de grumos (aglutinación). La aglutinación indica una reacción positiva antígeno-anticuerpo y permite determinar el título de anticuerpos presente en el suero del paciente.

Interpretación

Diferenciación Bioquímica