Hipersensibilitat immediata

La valoració de la funcionalitat dels limfòcits és necessària per tal de valorar el funcionament del sistema immunològic, sobretot a nivell d’immunitat específica.

Tècniques de separació de limfòcits i PMN per centrifugació en gradient de Ficoll

És la tècnica més utilitzada per separar els limfòcits de la resta de components de la sang. Es dilueix la sang total desfibrinada en un medi de cultiu i es col·loca sobre un tub ple fins a la meitat de Ficoll. A continuació es centrifuga i s’aconsegueix la separació dels limfòcits de la resta de components de la sang.

El medi està format per 2 compostos:

Ficoll 400

Polímer sintètic de sacarosa i epiclorhidrina Té una densitat més gran que els limfòcits però menor que els eritròcits i granulòcits. A més provoca l’aglutinació dels eritròcits.

Diatrizoat de sodi

Compost que quan es barreja ab el Ficoll, forma solucions de baixa viscositat i alta densitat.

-Banda superior

Plasma

-Banda intermèdia

De color blanc, conté cèl·lules mononuclears (limfòcits,monòcits i plaquetes).

-Banda inferior

De color vermellós, sediment format per eritròcits i granulòcits.

RESULTAT

Quantificar la viabilitat cel·lular amb blau de tripà i fer el recompte. 

ESTUDI DE FUNCIONALITAT DE LB

Per avaluar la funcionalitat dels LB s’indueix la seva divisió in vitro mitjançant diversos estímuls i es quantifiquen nivells Ig (IgG, IgM i IgA) amb IDR. En casos d’immunodeficiències amb fallada en la producció de IgM es recomana la determinació de la presència d’Ac naturals o isohemaglutinines Anti-A i Anti-B mitjançant ELISA. 

ESTUDI DE FUNCIONALITAT DE LT

El nivell de proliferació de LT pot fer-se per diferents vies:

Estudis de proliferació en resposta a mitògens:

Quan els LT sensibilitzats enfront un Ag es cultiven en presència d’aquest o d’un agent mitogen, responen transformant-se en limfoblast, que es divideixen activament. Aquesta proliferació suposa una síntesi d’ADN, que es pot mesurar mitjançant la taxa d’incorporació de timidina tritiada als nuclis de les cèl·lules. Lectura de la radioactivitat.

Estudis de la proliferació per citometria de flux:

 s’utilitza la capacitat del CFSE per marcar els limfòcits i mesurar la reducció de la intensitat de la fluorescència, que serà proporcional a la activitat mitòtica.

Valoració de producció de citocines

S’usa ELISPOT o ELISA per a la determinació de citocines en sobrenedants.

Prova de la hipersensibilitat cutània retardada  Test de transformació limfoblàstica (TTL)

Mètode “in vitro” més simple, reproduïble, ràpid i semiquantitatiu. Consisteix en exposar la sang extreta d’una persona que conté els LT amb una o varies substàncies que es pretenen estudiar com a causa de l’al·lèrgia, per determinar si els limfòcits de la sang reaccionen davant d’ells. En cas que hi hagi resposta la prova serà positiva. 

Estudi de la funció fagocítica de PMN i monòcits

 s’incuba una fracció de leucòcits de sang perifèrica amb una suspensió de partícules inerts (microesferes de làtex) o de microorganismes (bacteris com Staphylococcus o altres per permetre la fagocitosis, i posteriorment quantificar-la mitjançantl’observació de cèl·lules tenyides. L’inconvenient d’aquestes tècniques és que no diferencien entre partícules fagocitades i adherides a la superfície es pot aplicar la citometria de flux: marcant bacteris amb un colorant fluorescent.

Estudi de la funcionalitat de PMN i basòfils

S’utilitzen la tècnica de reducció de NBT  i la mesura de radicals lliures.

Molècules Antígens Leucocitaris Humans (HLA)

s’anomenen també antígens leucocitaris humans (HLA). Són el producte d’un conjunt de gens localitzats al cromosoma 6. Són els responsables de que els limfòcits rebutgin els teixits trasplantats i detectin elements estranys. Participen per tant en: Inducció de la resposta immune específica, a través de la presentació de l’antigen als LT i Inhibició de les NK.

Els gens HLA es poden englobar en 3 categories o classes:

• Gens de classe I:

–   Codifiquen per glicoproteïnes de la superfície de cèl·lules nucleades.

–   Funció: presentar Ag a LT CD8+

• Gens de Classe II

– Codifiquen per glicoproteïnes de la superfície de les APC (macròfags, c. Dendrítiques i LB).

–   Funció: presentar Ag a LT CD4+

• Gens de Classe III

– Codifiquen proteïnes relacionades amb el SI com el SC i el factor de necrosis tumoral (TNF) i d’altres citoquines inflamatòries.

Tipus de molècules HLAa) Molècules de classe I o MHC-I:

Glicoproteïnes formades per:

-1 cadena pesada α: -Amb tres dominis, α-1, α-2 i α-3. -1 cadena lleugera β la β2 microglobulina (lloc uníó LTCD8) -1 segment hidrofòbic (domini transmembrana) -1 segment hidrofílic (domini intracitoplasmàtic Localització:
Cèl·lules nucleades de l’organisme. No elstrobarem en eritròcits.

Funcions

Presentació dels Ag a les LTc (CD8+) ireconeixement d’Ag propis  (Si en algun moment alguna cèl·lula perd aquest receptor, és considerada com a no pròpia i destruïda)

B) Molècules de classe II o MHC-II: Glicoproteïnes formades per dues cadenes α i β:

• Molt similars en mida

• Molt  variables  en  els  seus  dominis  extracel·lulars  α-1  i

α-2 i β -1 i β -2.

• Domini d’uníó al pèptid: entre α-1 i β -1 (10-25aa)

• 2 segment hidrofòbic (domini transmembrana)
• 2 segment hidrofílic (domini intracitoplasmàtic)

Localització:

APC (cèl·lules fagocítiques, cèl·lules dendrítiques i LB)

Funció:

presentar els Ag processats als LTH (CD4+).

C) Molècules HLA-III

No són proteïnes de membrana. No intervenen en la presentació d’Ag. Són proteïnes relacionades amb funcions immunitàries:

• SC – C4a, C4b, C2 i Factor B.

• Citoquines proinflamatòries, inclòs el factor de necrosi tumoral TNF relacionats amb la inflamació i proteïnes d’estrès tissular.

5.1.2. Processament i presentació d’antígens

Les cèl·lules encarregades de presentar els pèptids units a molècules HLA-II són les cèl·lules presentadores d’Ag (APC) i els pèptids units a molècules HLA-I : cèl·lules diana.

1)   PROCESSAMENT d’Ag per APC - via endocítica o de classe II

Els tres tipus de cèl·lules que poden fer-ho són: cèl·lules dendrítiques, cèl·lules capacitat fagocítica (macròfags, neutròfils i eosinòfils) i LB. El processament es dóna en diferents etapes:

A)    INCORPORACIÓ D’AG DEL MEDI EXTERN PER:

• Pinocitosi: vesícula amb líquid i molècules dissoltes o partícules sòlides en suspensió.

• Fagocitosi: formació de pseudopodis per captar partícules o m.O. En un fagosoma.
  • Endocitosi regulada pe receptor

1. INTERNALITZACIÓ DE L’Ag EN VESÍCULES INTRACEL·LULARS DE BAIX pH. Es produeix el fraccionament de l’Ag i la seva degradació fins a pèptids. La vesícula o el fagosoma format es fusiona amb els lisosomes constituint el fagolisosoma on les proteases i el pH baix ajuden a la degradació dels pèptids.

c)    BIOSÍNTESI HLA-II En el Reticle Endoplasmàtic es procedeix a la biosíntesi de molècules HLA-II. Aquestes es formen al RE i s’estabilitzen amb una cadena invariant(Li).

1. UníÓ  DEL  PÈPTID  A  LA  MOLÈCULA  HLA-II  I  TRANSPORT  I  EXPOSICIÓ  A  LA

SUPERFÍCIE CEL·LULAR: El complex (HLA-II+li) surt del RE i es trasllada al compartiment de càrrega de pèptids. Aquí s’inicia la proteòlisi  quedant només la porcíó de Li que forma el CLIP (cadena associada de pèptids). El CLIP es separa de HLA gràcies a l’acció de la proteïna HLA-DM. HLA-II i HLA-DM es separen si HLA s’associa a un pèptid que li confereixi prou estabilitat. D’aquesta manera es forma el complex estable HLA-II/pèptid que viatja a la superfície cel·lular de la APC per via vesicular, on queda fixada a la membrana plasmàtica.

e)    ACTIVACIÓ DE LTH: Si aquesta molècules és detectada per un LTh en provoca l’activació i l’inici de la RI relacionats amb fenòmens citotòxics al final de la resposta.

2)   Processament d’Ag per cèl·lules diana – via citosòlica o classe I

Es realitza en la majoria de cèl·lules nucleades. Aquestes cèl·lules es caracteritzen per utilitzar pèptids que provenen del processament de proteïnes ja presents a l’interior de la cèl·lula (Ag

ENDÒGENS). Aquests pèptids poden venir de proteïnes virals, proteïnes tumorals,...

Etapes del processament:

A) Biosíntesi molècules HLA es realitza al RE. Allà el dímer de cadena alfa pesada i la beta2 és inestable, per això s’uneix a la calnexina i a altres molècules (calreticulina (xaperones)).

1. PROTEOLISI DE PROTEINES AL CITOSOL PER PRODUIR PÈPTIDS. Això es fa gràcies a les proteases que hi ha als proteosomes cel·lulars.

1. Transport dels pèptids al RE: Es fa amb l’ajuda de la proteïna TAP1 i TAP2 (complex de transport de pèptids Antigènics) i la tapassina. Transporten i formen un canal de pas.

D) Posteriorment la molècula HLA-I s’uneix al pèptid més estable i és transportada mitjançant una vesícula d’excreció (exocitosi) generada a l’Aparell de Golgi, fins a la membrana cel·lular on quedarà ancorada exposant-se als receptors dels LTc

Com que les APC presenten simultàniament MHC-II i MHC-I ha d’haver-hi algun mecanisme que eviti que al RE, les HLA-II s’uneixin als mateixos pèptids que les molècules HLA-I (fa un tap la cadena invariant).

3)   Processament d’Ag lipídics o 3a via o via CD1

La realitzen proteïnes molt semblants a les del MHC-I, les proteïnes CD1

Els lípids poden arribar-hi pels 2 mecanismes vistos anteriorment:

• Endocítics (fagocitosi m.O. Patogen – hidròlisis de lípids al fagolisosoma).
• Citosòlics al RE (lipòlisi)

5.1.3. Polimorfismes de les molècules HLA i necessitat d’estudi

El conjunt de gens HLA és el més polimòrfic⁴ del genoma humà. El polimorfisme és tant gran que en una població mixta (no endogàmica) no existeixen dos individus que tinguin exactament el mateix joc de gens, i molècules HLA, excepte en bessons idèntics. La variació en les molècules HLA està relacionada amb la capacitat de regular la uníó amb els diferents pèptids antigènics.

Es creu que aquesta diversitat pot ser deguda a diversos mecanismes:

• Recombinació homòloga entre al·lels d’un mateix locus.

• Conversió genètica: una seqüència d’un al·
  lel d’un locus HLA pot ser reemplaçada per una altra seqüència d’un gen homòleg.
• Mutacions puntuals: que introdueixen aa diferents dels originals.

Els aa més variables es localitzen en el solc o domini d’uníó al pèptid. Aquesta és la diferència per la qual unes molècules HLA responen a uns pèptids i no a uns altres:

• Molècules HLA-I:

–   Longitud dels pèptids 8-10 aa.

– Domini d’uníó tancat pels extrems i presenta “ancoradors” en els extrems carboxi i aminoterminals (aa que determinen el tipus de pèptid que s’hi pot unir).

–   Més afinitat d’uníó (uníó de 100 a 1000 vegades superior que en les molècules

HLA-II

• Molècules HLA-II:

–   Longitud del pèptids de 12-20 residus.

–   El domini d’uníó està obert per els seus extrems.

– Petites variacions en el motiu d’uníó (aa base del solc) fa que siguin capaços d’unir-se a molts Ag diferents.

L’expressió dels gens HLA és codominant, això vol dir, que els al·lels heretats dels dos progenitors s’expressen de forma equivalent. Així cada persona tindrà un joc de cada progenitor en les molècules HLA-I:

• HLA-A (HLA-A1 i HLA-A2)

• HLA-B (HLA-B1 i HLA-B2)
• HLA-C (HLA-C1 i HLA-C2)

El mateix passa pels locus de Classe II, cada individu hereta un parell de gens HLA-DP DPA1 I DPA2, igual per HLA-DR, HLA-DQ,…

Aquest joc d’al·lels present en cada cromosoma s’anomena haplotip HLA i rep un número.

Ex: HLA-A*01

Com que ja hem vist que els gens HLA són molt polimòrfics, això vol dir que existeixen molts al·lels diferents en els individus de la població. Degut al elevat nombre d’al·lels existents el 1968 es va crear el comitè per la nomenclatura dels diferents al·lels HLA “WHO Nomenclature Comittee for factors of the HLA System”

Segons les directrius d’aquest comitè, cada al·lel rep el nom en funció de:

–   Gen

–   * informació al·lèlica +Xifra numèrica de 1 a 4 dígits (com a mínim 2)

L’alt grau de polimorfisme és una resposta evolutiva per tal de protegir a les diferents espècies de vertebrats enfront els diversos m.O. Patògens. En alguns casos però, l’alteració dels gens que codifiquen per a aquestes molècules poden causar l’aparició de patologies en els individus.

PER QUÈ S’ANALITZEN LES MOLÈCULES HLA EN CLÍNICA?

S’ha observat que algunes malalties s’associen amb determinats al·lels del HLA:

• M. Autoimmunes.
• Susceptibilitat a virus
• Alteracions neurològiques i del SC
• Algunes al·lèrgies.

Cal tenir en compte que, en quasi tots els casos hi intervenen també: gens no situats al complex CMH i factors ambientals.

En malalties infeccioses, la susceptibilitat a un patogen es pot relacionar amb el paper de determinats al·lels del HLA en la resposta o absència de resposta contra aquest patogen. Així doncs, el polimorfisme HLA en una població tendeix a protegir l’espècie enfront agents infecciosos, ja que amplia la varietat d’Ag que es poden reconèixer. Llavors si per algun problema (disminució núm. Exemplars) disminueix el polimorfisme, augmenten el risc de malalties infeccioses en poblacions.

Ex: Guepard amenaçat d’extinció

• Augmenten malalties congènites.
• Disminueix la varietat d’haplotips de CMH.

Resultat: Limita el nombre de pèptids que poden processar aquestes molècules, són més susceptibles a infeccions víriques. Es pot arribar a determinar els al·lels responsables de la susceptibilitat i la resistència.

En humans el tipatge serològic i genètic HLA tal i com veurem en el següent apartat s’utilitza per:

• A) Associació d’al·lels HLA amb una malaltia quan hi ha sospita d’aquesta.

• B) Estudi d’histocompatibilitat en donants.
  • C) Estudis de paternitat

• D) Estudis antropològics per establir possibles relacions entre diferents poblacions o grups ètnics.

1. Estudis d'histocompatibilitat HLA: serològics i biologia molecular (PCR)

   
   

Amb aquests estudis esbusca la màxima igualtat (compatibilitat HLA) de molècules HLA, entre donant i receptor per evitar el rebuig. Prèviament cal fer una determinació del grup sanguini. S’usen tècniques moleculars.

El rebuig de transplantaments

Un trasplantament o injert és la transferència de cèl·lules vives, òrgans o teixits d’una part de l’organisme a una altra o d’un individu a un altre.

Segons la relació que existeix entre el donant i el receptor parlarem de:

o     Autotrasplantament:
L’injert en el que donant i el receptor són el mateix individu. Ex: transplantaments de pell,

o     Trasplantament singènic o isotrasplant:
Es realitza entre dos individus que sóngenèticament idèntics. Ex:bessons univitel·lins

o     Al·lotrasplantament:
Entre dos individus diferents que pertanyen a la mateixa espècie(homotrasplantament).

o     Xenotrasplantament:
Efectuat entre dos individus d'espècies diferents.

El procés de rebuig és complex i hi intervenen varies de les cèl·lules que participen en les diferents reaccions d’hipersensibilitat. Hi intervenen tant elements de la immunitat cel·lular com de la humoral, i s’hi afegeix el fet que no participen tots de la mateixa manera en cada transplantament. Aquest fet fa molt difícil trobar una solució a aquest problema.

Les cèl·lules T CD8+ (LTc) i CD4+ (LTh) reaccionen enfront els Ags MHC processats dels injerts

(fenòmens d’hipersensibilitat IV). Les conseqüències d’aquesta reacció:

• Citòlisis directa regulada pels LTC
• Lesió de la microvascularizació, isquèmia del teixit
• Destrucció regulada pels macròfags.

Existeixen diferents tipus de rebuig:

REBUIG HIPERAGUT (Ig):

Dones multípares, Individus que reben un segon al·loinjert,
En casos d’incompatibilitat entre el receptor i l’al·loinjert en el sistema ABO sanguini, de forma immediata en un temps que varia de minuts a 1 o 2 dies i en el que els Acs circulants preformats s’uneixen als Ags en el vasos de l’injert, provocant una lesió regulada pel complement i de tipus ADCC

(hipersensibilitat  tipus II).

REBUIG AGUT(CELULES):

Es produeix als pocs dies del trasplantament o després de la interrupció del tractament immunosupressor (HPS tipus IV). Causa són mecanismes cel·lulars i humorals.Clínicament s’observa:Leucocitosi, Hipertensió arterial, Proteïnúria, Disminució del volum urinari.El rebuig agut cel·lular es caracteritza per observar-se infiltrat intersticial de cèl·lules mononuclears (macròfags, cèl·lules plasmàtiques, LTh i LTc)

.

És típic que el rebuig cel·lular respongui ràpidament als fàrmacs immunosupressors.

REBUIG CRÒNIC:

Es produeix després de mesos o anys. Es caracteritza per la pèrdua progressiva de la funció de l’òrgan trasplantat (augment de la creatinina sèrica) sense dades de rebuig agut i tot i el tractament immunosupressor.

Factors que influeixen en el rebuig d’òrgans

• Es busca la màxima compatibilitat entre donant i receptor.

• Cal assegurar-se que el receptor no té Acs preformats contra Ags HLA del donant.
• Es realitza teràpia immunosupressora després del trasplantament.

5.2.1. ESTUDIS O TÈCNIQUES SEROLÒGIQUES

A

Assajos d’aglutinació

Van permetre descriure el polimorfisme en les molècules HLA per primer cop. Per fer-ho es van posar en contacte sèrums de dones multípares o pacients politransfosos que presentaven anti-HLA poliespecífics, amb cèl·lules de donants.

Avui en dia ja no s’utilitza, ha estat substituïda per la microlimfotoxicitat.

1. Tècniques serològiques – microlimfotoxicitat o citotoxicitat regulada per complement (CCD)

   
   

Mètode més usat per identificar els tipus de molècula HLA presents en les membranes cel·lulars dels limfòcits vius (pacient a estudiar). Es realitza en una placa de Terasaki en la que s’hi enfronten:

• Limfòcits del donant a estudiar .

• Bateria  d’Ac  monoclonals  específics  per  cada  una  de  les  molècules  HLA  possibles.

Provenen de Els Ac per al tipatge són monoclonals i provenen de dones multípares o pacients politransfosos o trasplantats

Posteriorment s’afegeix el complement (prové de conills). Així, en els pouets en els que hi hagi IC Ac-molècula HLA, es produirà lisi cel·lular visible al microscopi.

Per identificar les cèl·lules mortes i vives poden usar-se:

Fluorocroms

•      Taronja             d’acridina:             tenyeix

cèl·lules de vermell i ens indica quines estan mortes ja que es fixa

a l’ADN.

• Bromur d’etidi: tenyeix cèl·lules vives de color verd brillant.

Colorants d’exclusió o vitals:

• Blau de tripà: només és capaç de penetrar en cèl·lules mortes

• Cèl·lules clares i refringents cèl·lules vives.

Pel tipatge HLA solen usar-se LB perquè s’obtenen fàcilment en mostres de sang perifèrica, melsa o ganglis limfàtics i a més, en aquestes cèl·lules activades s’expressen més molècules HLA-II.

Es poden separar:

• Cromatografia.
• Centrifugació en gradient Ficoll (explicat anteriorment en les proves de funcionalitat)

• CMIA: Separació amb microesferes magnètiques acoblades a Ac dirigits a Ag específics (CD19). La sang es barreja amb les esferes i després aquestes cèl·lules es separen amb un camp magnètic (iman) i es rentar per procedir a la seva tipificació serològica.

Cal tenir present alhora d’interpretar els resultats que hi ha molècules que comparteixen epítops i per tant poden donar-se reaccions creuades.

Avantatges:

• Tècnica senzilla que requereix poc equipament sofisticat (microscopi invertit d’epifluorescència)

Inconvenients:

• La tècnica ha de realitzar-se sense interrupció, ja que es treballa amb cèl·lules viables.
• Alt cost i baixa resolució

• No existeixen sèrums contra al·lels poc freqüents.

• No es detecten Ac que no són capaços de fixar el complement (IgA, IgE)

• La majoria dels sèrums no són monoespecífics i a més presenten reactivitat creuada.
• Interpretació difícil per escassetat de sèrums monoespecífics i reaccions creuades.

C

Prova creuada o cross-match per citometria de flux

Determina l’existència d’Ac específics pre-formats enfront les molècules HLA el donant, causants dels rebuigs hiperaguts, que comporten uníó dels Ac-antiHLA amb les cèl·lules endotelials, activació del SC per via clàssica, inflamació, trombosi i destrucció de l’òrgan trasplantat.

Per fer-ho al igual que en la prova de CCD, s’enfronten cèl·lules del donant amb el sèrum dels receptores potencials. I s’hi afegeix un Ac-AntiIg humana de cabra o conill conjugat amb un fluorocrom. Finalment s’analitza la fluorescència amb el citòmetre.

Una lisi superior al 20% es considera prova creuada positiva, el transplantament estarà contraindicat. En canvi si és inferior al 20%, es considera negativa i el transplantament és viable.

D

Detecció d’Ac anti-HLA (PRA- panel reactivity antibody)

S’utilitza per avaluar períòdicament en pacients en llista d’espera la presència d’anticossos anti-HLA.

Per fer-ho, s’enfronta un panell representatiu dels antígens HLA de la població amb el sèrum del pacient. Així es pot observar quin és el percentatge de limfotoxicitat d’un pacient. Quan més sensibilitzat estigui, menor serà la possibilitat d’obtenir un resultat negatiu en la prova creuada, i pera tant menor la possibilitat de trobar un donant compatible, és a dir, a major PRA, menys oportunitats de ser trasplantat.

Destacar que la font més comuna de sensibilització és la transfusió sanguínia, els transplantaments previs i els embarassos o avortaments. S’estima que al voltant del 30% dels individus que han estat exposats a aquestes situacions estan sensibilitzats i produeixen anticossos Anti-HLA.

5.2.2.  ESTUDIS O TÈCNIQUES MOLECULARS

L’elevat polimorfisme de les molècules HLA no pot analitzar-se completament amb les tècniques serològiques, per això s’han desenvolupat tècniques moleculars capaces de detectar les diferències al·lèliqües.

Totes les tècniques moleculars es basen en l’amplificació de fragments d’ADN mitjançant l’ús de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR), de manera que es poden detectar polimorfismes directament en els gens que codifiquen per a les proteïnes HLA.

Es tipifica la presència de les molècules dels locus:

Els mètodes més utilitzats són:

A)

RFLPs (Restriction fragment length polymorphism)

Utilitza enzims de restricció que reconeixen seqüències específiques del DNA (llocs de restricció). D’aquesta manera, la freqüència d’una seqüència específica del DNA determinarà la

mida dels fragments de DNA produïts al tallar amb un enzim de restricció. Aquests fragments es visualitzen després de l'electroforesi en gel d’acrilamida.

Cada Ag HLA té uns llocs de reconeixement per aquests enzims de restricció diferents d’altres, fet que genera diferents patrons de bandes que permeten diferenciar els Ag HLA. Va ser la primera tècnica en la tipificació de molècules HLA-II.

Actualment ja no s’usa ja que és una tècnica amb baixa resolució, laboriosa i que requereix molta quantitat d’ADN.

B)  PCR-RFLPs

Combinació de les dues tècniques.

• Primer es fa una amplificació de la regió HLA.

• Després s’usa un panell d’enzims de restricció que dirigeix els productes resultants de la PCR abans de la seva visualització al gel d’acrilamida.

La interpretació de les especificitats es basa en la distribució dels llocs de restricció assignats a cada al·lel. Actualment no s’usa massa ja que té una resolució baixa i és poc reproduïble.

Procediment:

1. Amplificació de la regió que codifica per la molècula HLA.

1. Addicció dels enzims de restricció que reconeixen seqüències concretes de cada al·lel.

1. Observació:

• Si el DNA de la mostra presenta el lloc específic s’observaran dues bandes.

• Sinó només una.

C)

PCR–SSP (sequence specific priming – primers de seqüència específica)

Tècnica en la que s’amplifiquen seqüències completes de la molècula HLA amb l’ajuda de primers específics per cada seqüència.

Etapes:

1. Extracció de sang del pacient.

1. Aïllament de l’ADN de les cèl·lules sanguínies.

1. Reacció de cadena de polimerasa (PCR)

amb diferents combinacions de "primers". Els primers (encebadors específics de seqüència): són oligonucleòtids complementaris per a cada al·lel de la molècula HLA específica. Així s’amplifiquen fragments d’ADN de diferent longitud.

1. Electroforesis en gels d’agarosa que conté bromur d’etidi, per comprovar l’existència dels productes amplificats (apareixeran

1. Observació del patró de bandes d’ADN amplificades en la PCR sota llum UV i identificació de les bandes.

1. Integració dels resultats obtinguts.

1. Assignació d’al·lels a la mostra analitzada.

Avantatges:

• Poc equipament sofisticat (màquina per la PCR)
• No requereix aïllament de cèl·lules (sang total)
• Permet resoldre ambigüitats.

• Resolució major que les tècniques serològiques
• Cost relativament baix

• Es pot interrompre la tècnica en diversos passos.

Inconvenients

• Cada parell de "primers" permet amplificar un o pocs al·lels del HLA, com que hi ha molt de polimorfisme, serà necessari utilitzar molts primers amb la finalitat d’obtenir una resolució acceptable d’al·lels de la mostra (fer moltes PCR – per cada primer).

• Cada mostra requereix un nombre elevat de reaccions PCR que es realitzin de forma simultània per tant no resulta pràctic.

1. PCR-SSO o SSO (sequence specific oligonucleotide - sondes d’oligonucleòtids de seqüència específica)

   
   

Fonament:

Es realitza una reacció de cadena de polimerasa (PCR) utilitzant com a motlle l’ADN de cèl·lules de la sang perifèrica del pacient.

• Primers: s'utilitzen sondes d’oligonucleòtids específics per diferents locus del gen HLA (conté les regions on es diferencien els al·lels)
• S’amplifica per separat el locus HLA-A, el locus HLA-B, ….

Els fragments d’ADN amplificats són immobilitzats sobre membranes de niló i hibriditzats amb sondes marcades (oligonucleòtids complementaris), específiques per a diferents al·lels de l’HLA.

El patró de senyals obtingudes d’acord a les sondes que han reaccionat es detecta amb plaques d’autoradiografies, el que permet assignar un al·lel a la mostra analitzada.

Etapes del procés:

Avantatges:

• No requereix aïllament de cèl·lules (sang total)
• Alta resolució
• Es pot interrompre en diversos passos.

• Adequat per a tipificar donants cadavèrics.

• Utilitzant sondes marcades amb digoxigenina i Ac Anti-dioxifenina marcats amb perioxidasa, es pot realitzar la detecció per quimioluminiscència, pel que no es generen desfets radioactius.

• Permet la detecció d’al·lels “nuls”
• Permet l'anàlisi simultani d’un número gran de mostres

Desavantatges:

• Interpretació complexa (reactivitat creuada entre sondes, detecció de determinades combinacions d’al·lels produeixen patrons similars en les plaques d’autoradiografia)

• Les condicions de rentat de les diferents sondes poden ser diferents, el que complica en processament simultani de moltes mostres.
  • Elevada resolució però segueixen existint ambigüitats (menys que en les altres tècniques)
  • Tècnica complexa i costosa que requereix equipament més sofisticat .

1. LUMINEX

Adaptació de la PCR-SSO en medi líquid. Les sondes es troben immobilitzades a unes microesferes marcades amb fluorocroms (no en una membrana).

La hibridització es fa en un tub i l’anàlisi en un citòmetre de flux. En el citòmetre:

• 1r làser identifica el grup al que pertany la microesfera.

• 2n làser quantifica la fluorescència generada si hi ha reacció amb la sonda.
• Permet fer un anàlisi simultani de diferents mostres en un mateix test.

F)    PCR-SBT (Tipificació basada en la seqüencia - Sequence based typing

En aquesta tècnica es fa una seqüenciació directa per tal de determinar la seqüència de nucleòtids dels gens del sistema HLA amb “primers” específics per als diferents locis i marcadors específics per als diferents exons del gen HLA en qüestió.

1.Extracció de sang del pacient

2.Aïllament de l’ADN de les cèl·lules sanguínies

3.Reacció en cadena de la polimerasa (PCR) amb diferents "primers" específics per diferents loci del HLA (primer per HLA-A, HLA-B,...)

4.Electroforesis en gels d’agarosa per analitzar la qualitat de la reacció de PCR 5.Realització de la reacció de seqüència mitjançant "primers per a cada exó" marcats amb fluorocroms adaptats al tipus de detector del seqüenciador. (Analitzador automàtic de seqüències ADN)

6. Anàlisis de las seqüències obtingudes 7.Comparació amb la base de dades de les seqüències de l’aparell i integració dels resultats obtinguts.

8.Assignació d’al·lels HLA a la mostraanalitzada

Avantatges

• No requereix l'aïllament de cèl·lules (sang total)
• Alta resolució (màxima resolució possible)

• Es pot interrompre la tècnica en diversos passos.
• Ideal para la detecció de homozigosis.
• Interpretació automatitzada.

• Permet la detecció d’al·lels "nuls", és a dir, dóna informació dels al·lels polimòrfics tant coneguts com dels desconeguts. En les altres tècniques els desconeguts quedarien ocults.

Inconvenients

• Técnica sofisticada que requereix equipament complex i costós. (Seqüenciador ADN)

• Es poden analitzar un nombre reduït de mostres simultàniament (depenent del detector del seqüenciador)

1. Altres aplicacions dels estudis de l’HLA

   
   

A.  Estudis de paternitat

La genètica forense utilitza la variabilitat genètica com a eina per a l’identificació d’individus per tal de resoldre casos de relació parental i crims.

Al ser els gens HLA els gens humans de major polimorfismes, mitjançant el seu anàlisi es poden analitzar les relacions familiars entre pares i fills. L’anàlisi que es realitza al laboratori per conèixer aquest tipus de molècules o els seus al·lels s’anomena tipatge HLA.

Actualment, aquesta pràctica ha estat substituïda per tècniques d’ADN, que estudien les regions variables d’aquest. Generalment s’estudien els fragments d’ADN repetit en tàndem, que s’anomenen minisatèlits i microsatèl·lits. Les repeticions en l’ADN microsatèl·lit són de mida petita (2-6 parells de bases nitrogenades), per això solen anomenar-se Short Tandem Repeats (STR).

1. Estudis antropològics per establir possibles relacions entre diferents poblacions o grups ètnics

   
   

Les molècules de l’HLA són ideals per a la realització d’aquest tipus d’estudis ja que es tracta d’un sistema polimòrfic amb grans diferències de freqüències al·lèliqües entre grups humans.

Hem vist que els antígens s’hereten com haplotips complets i de forma codominant, cosa que provoca que la recombinació entre aquests al·lels no sigui freqüent. Aquest fet afavoreix el desequilibri genètic i el fet que hi hagi una major freqüència d’un haplotip en particular en una població .

Els resultats dels estudis de distribució de freqüències haplotípiques han permès saber quins són

els al·lels més freqüents  en determinats grups de població per ex: hispans, llatins, caucàsics,...

Algunes poblacions aïllades geogràficament es poden caracteritzar ràpidament degut al nivell elevat d’endogàmia.

Ex: Amish retenen haplotips dels sus ancestres europeus. Ex: poblacions natives americanes (ameríndies)

Amb això es pot fer un seguiment de les migracions i el mestissatge.

C) Associació d’al·lels a malalties

En termes mèdics, l’estudi de les molècules HLA també s’utilitza per confirmar el diagnòstic d’un pacient que es sospita que pateix una determinada malaltia associada a la presència de determinats tipus de molècules HLA.

S’ha observat que l’augment de la freqüència d’un determinat al·lel HLA, es pot associar a una major probabilitat de patir una malaltia. A aquests pacients se’ls xifra com a pacients amb “risc relatiu” (RR).