Sondas moleculares, hibridación de ácidos nucleicos y protocolo FISH

Sondas Moleculares: Definición y Características

Las sondas son segmentos de ADN o ARN marcados (con enzimas, sustratos antigénicos o radioisótopos) que se pueden unir con alta especificidad a una secuencia complementaria de ácido nucleico.

Para detectar la secuencia diana, una de las cadenas del ácido nucleico que participa en la hibridación debe estar marcada. El marcado de la sonda debe ser estable bajo diversas condiciones (temperatura, detergentes) y no debe afectar a la región de hibridación.

Hibridación de Ácidos Nucleicos

La hibridación de ácidos nucleicos consiste en la formación de moléculas bicatenarias (doble cadena) con hebras de ácidos nucleicos de distinto origen.

• Cuando ambas cadenas son de ADN o ARN, se denominan homodúplex (ADN-ADN o ARN-ARN).
• Cuando una cadena es ADN y la otra es ARN, se denominan heterodúplex (ADN-ARN).

La hibridación se denomina estándar cuando la sonda está marcada, mientras que si es la diana la que se marca, se denomina hibridación reversa.

Astringencia de la Hibridación

La astringencia se refiere a las condiciones que determinan la especificidad y estabilidad de la unión entre la sonda y la diana. A mayor astringencia, menor es el número permitido de errores de apareamiento (mismatches) en la hibridación.

Las condiciones de astringencia determinan la estabilidad de la doble cadena de ácidos nucleicos y varían según el objetivo de la prueba:

• Baja astringencia: Se necesitan para comparar el ADN de especies diferentes, permitiendo cierto grado de disparidad.
• Alta astringencia: Son precisas para identificar mutaciones puntuales en un gen, forzando una hibridación muy específica.

Hibridación In Situ

En la hibridación in situ, la sonda se hibrida directamente sobre la secuencia diana presente en un tejido, células o cromosomas que están fijados sobre un soporte sólido, habitualmente un portaobjetos.

Ventajas de las Técnicas de Array

Las técnicas basadas en arrays (no detalladas explícitamente aquí, pero a las que probablemente se refiere el texto original) ofrecen ventajas significativas:

• Mayor resolución que el cariotipo o la FISH.
• Datos más objetivos y reproducibles.
• Mayor rendimiento diagnóstico.
• Rapidez.
• Versatilidad.

Protocolo General de la Técnica FISH (Hibridación In Situ Fluorescente)

El protocolo de la técnica FISH (Fluorescence In Situ Hybridization), en general, incluye los siguientes pasos:

1. Fijación de la muestra: Su función es la preservación del ADN y de la morfología de la muestra.
2. Pretratamiento y preparación de las muestras: Su función es aumentar la accesibilidad de la sonda al ADN de la muestra, digiriendo las estructuras tisulares extracelulares y permeabilizando las membranas celulares y nucleares.
3. Desnaturalización: Es la separación de las cadenas de la doble hélice del ADN (tanto en la muestra como en la sonda) para permitir la hibridación con la sonda complementaria.
4. Hibridación: Proceso por el cual el ADN de la sonda se une con el ADN de la muestra por complementariedad de bases.
5. Lavados post-hibridación: Se realizan para eliminar el exceso de sonda que no se ha unido específicamente al ADN de la muestra y las señales inespecíficas.
6. Contratinción: Permite visualizar el fondo de la preparación (ej. núcleos celulares) para contextualizar la señal de la sonda.