Fundamentos y Métodos de Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos (AN)

1. Pretratamiento de Muestras para la Extracción de Ácidos Nucleicos (AN)

Indica qué tipo de pretratamiento aplicarías a las siguientes muestras para iniciar un proceso de extracción de AN y qué materiales o reactivos emplearías.

• a) Cultivo celular en monocapa

  Pretratamiento: Despegar la monocapa de células adheridas a la pared del frasco de cultivo.

  Reactivos/Materiales: Raspado mecánico o tripsina.

• b) Esputo

  Pretratamiento: Fluidificación con un agente mucolítico (del tipo sódico).

  Reactivos/Materiales: Si el microorganismo que se quiere detectar es micobacteria, se puede añadir también hidróxido sódico para descontaminar la muestra.

• c) Sangre

  Pretratamiento: Lisis de los hematíes (romper los hematíes con solución o tampón de lisis 1:3).

  Proceso: Centrifugar la muestra, eliminar los componentes del plasma y hemoglobina, conservando el sedimento (leucocitos).

• d) Tejidos vegetales frescos

  Pretratamiento: Homogeneización mecánica (pulverizando el tejido en mortero con nitrógeno líquido).

  Alternativa: Homogeneización química con proteasa y detergentes.

• e) Biopsias de tejidos animales fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE)

  Pretratamiento: Desparafinado y rehidratación de 3 cortes de 1 mm obtenidos con micrótomo mediante homogeneización secuencial con xilol-etanoles de graduación decreciente y agua destilada.

  Proceso: A continuación, se somete el tejido a homogeneización química con proteasa y detergentes.

2. Procesos Fundamentales en la Extracción de Ácidos Nucleicos

Respecto a la extracción de AN, nombra:

• a) Dos procesos fundamentales para conseguir una buena extracción

  1. La lisis celular para liberar los AN.
  2. La inactivación de las nucleasas celulares (ADNasa/ARNasa) para evitar la degradación de los AN.

• b) Dos detergentes utilizados en soluciones de lisis celular

  1. Dodecil Sulfato Sódico (SDS).
  2. Bromuro de Cetil Trimetil Amonio (CTAB).

• c) Dos agentes inactivadores de nucleasas

  1. Isotiocianato de guanidinio (inactiva la ARN polimerasa y otras enzimas).
  2. EDTA (inactiva la ADN polimerasa).

• d) Dos enzimas que digieran la pared bacteriana o vegetal

  1. Lisozima o Lisostafina (para degradar la pared de bacterias Gram positivas).
  2. Liticase o Zymolase (para células vegetales, levaduras u hongos).

3. Métodos de Purificación de Ácidos Nucleicos y sus Fundamentos

Relaciona los siguientes métodos de purificación de AN con sus respectivos fundamentos:

• Cromatografía de adsorción: Adsorción a sílice en presencia de sales caotrópicas.
• Solventes orgánicos: Distintas solubilidades de los componentes del lisado en solventes orgánicos.
• Cromatografía de intercambio iónico: Unión reversible electrostática de iones a grupos funcionales.
• Salting-out: Precipitación de proteínas con altas concentraciones salinas.
• Ultrafiltración: Retención por tamaños de la molécula de AN.
• Esferas magnéticas: Adsorción o unión por afinidad a microesferas magnéticas.

4. Función de Reactivos en la Purificación de Plásmidos por Lisis Alcalina

Describe la función que cumplen los siguientes reactivos en la purificación de plásmidos mediante métodos de lisis alcalina:

• a) Dodecil Sulfato Sódico (SDS) en el tampón de lisis

  Agente tensioactivo que provoca la lisis de las bacterias.

• b) NaOH en el tampón de lisis

  Desnaturalizar el ADN bacteriano (cromosómico) y el ADN plasmídico.

• c) Acetato potásico en la solución de neutralización (pH 4.8)

  Provoca la neutralización brusca, lo que resulta en la precipitación de proteínas y la reasociación aleatoria e intercatenaria del ADN cromosómico. Esto ayuda a atrapar el ADN cromosómico no neutralizado.

• d) ARNasa

  Enzima utilizada para digerir y eliminar el ARN contaminante.