Biología molecular: extracción, cuantificación, PCR, electroforesis y plásmidos

1. Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos

• Lisis: Las células sanguíneas o seminales se someten a soluciones hipotónicas para provocar su ruptura por ósmosis. En muestras tisulares, se utiliza un buffer de lisis con detergentes para liberar el contenido celular y romper las membranas.
• Aislamiento: Tras la centrifugación, se obtiene el sobrenadante (fase acuosa con ADN), lípidos en la fase de fenol (más densa), proteínas en la interfase y restos celulares en el sedimento.
• Precipitación: El uso de etanol absoluto y sales reduce las fuerzas repulsivas en las cadenas, permitiendo que el ADN se pliegue y se vuelva insoluble. Se trabaja a 0ºC para disminuir la energía cinética de las moléculas. Finalmente, se utiliza buffer TE para su conservación.
• Buffer de lisis: Contiene componentes como Nonidet, proteinasa K e inhibidores de DNasa.

Cuantificación y Pureza

• Espectrofotometría: Los ácidos nucleicos absorben luz UV a 260 nm. En una cubeta de 1 cm, una absorbancia (DO) de 1 equivale a 50 µg/ml de ADN genómico de doble cadena.
• NanoDrop: Requiere volúmenes mínimos (1-1,5 µl) con un rango de detección de 2-3700 ng/µl.
• Qubit: Utiliza fluorocromos para medir ácidos nucleicos y proteínas, permitiendo cuantificar cadenas simples y dobles. Una relación de absorbancia 260/280 de 1,7-2,0 es óptima; valores superiores a 2 sugieren contaminación por fenol.

2. Genoma y Amplificación por PCR

• El genoma humano contiene un 3% de regiones codificantes, mientras que el 50% restante corresponde a secuencias intergénicas y repetidas.
• Minisatélites: Secuencias de 16 nucleótidos con variaciones de 14-72 repeticiones.
• Alu: Elemento transponible presente, por ejemplo, en el intrón 8 del gen activador del plasminógeno.
• PCR: Técnica para obtener un fragmento de ácido nucleico específico denominado amplicón.

Diseño y Ciclo de PCR

• Primers: Deben tener una distribución equilibrada de ATCG, evitar secuencias terminales complementarias entre sí y prevenir la autocomplementariedad.
• Ciclo térmico:
  • Desnaturalización: 95 ºC.
  • Hibridación: 67 ºC (minisatélites) o 65 ºC (Alu).
  • Polimerización (Extensión): 72 ºC mediante Taq polimerasa.

Electroforesis en Gel de Agarosa

La velocidad de migración depende de:

• Tamaño: Las moléculas grandes migran más lentamente.
• Concentración de agarosa: A menor concentración, poros más grandes.
• Campo eléctrico: A mayor voltaje, mayor velocidad pero menor resolución.
• Fuerza iónica: Es necesaria para la conductividad.
• Temperatura: Rango óptimo de 4-30 ºC. El ADN, al tener carga negativa, migra del polo negativo al positivo.

3. Plásmidos y Clonación

Son replicones autónomos (poseen origen de replicación u ORI), genes de resistencia a antibióticos y sitios de reconocimiento para enzimas de restricción. Su aislamiento mediante desnaturalización alcalina (SDS a pH 12) seguida de neutralización (acetato a pH 7) permite separar el ADN plasmídico del genómico bacteriano. Algunos plásmidos, como el del fago lambda, codifican para la enzima β-galactosidasa.

4. Enzimas de Restricción (ER)

Para una digestión óptima se requiere:

• pH: 7,2-8,5.
• Temperatura: 37 ºC.
• Cofactores: Adición de Mg2+.
• Volumen de reacción: 10-50 µl.