¿Qué es un amplicón en PCR?

Es el producto generado por la amplificación de ADN en una reacción de PCR usando un par de cebadores. Corresponde a la región delimitada por los dos cebadores.

¿Qué función tienen los iones magnesio en la PCR?

El magnesio (Mg2+), normalmente agregado como cloruro de magnesio, actúa como cofactor de la ADN polimerasa.

¿Por qué la ADN polimerasa usada en PCR debe ser termoestable?

Porque la PCR implica ciclos repetidos de desnaturalización a altas temperaturas, y la enzima debe sobrevivir a ellas para seguir amplificando.

Fundamentos de la PCR: componentes de la mezcla, polimerasas y cebadores

Resumen

El documento repasa los fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR): la identificación de cebadores F y R y del amplicón sobre el ADN molde, las características de las ADN polimerasas termoestables y la diferencia entre polimerasas con y sin actividad correctora. También enumera los componentes de una mezcla estándar de PCR y la función de cada uno.

Puntos clave

El cebador F (forward) se une a la hebra molde y el R (reverse) sintetiza la cadena complementaria; el amplicón es el fragmento amplificado delimitado por ambos cebadores.
Una ADN polimerasa usada en PCR debe ser termoestable y tener actividad de cadena para sintetizar ADN durante los ciclos de calentamiento.
Las polimerasas con actividad correctora (exonucleasa 3'-5') revisan y corrigen errores de replicación; las que carecen de ella no.
Los cebadores suelen tener entre 18 y 22 nucleótidos, deben estar enfrentados y no distar más de unos 4 kb.
Una mezcla estándar de PCR incluye ADN molde, dNTPs, dos cebadores, ADN polimerasa (la más común es la Taq), iones divalentes como Mg2+, iones monovalentes como K+ y una solución tampón.
El Mn2+ se emplea en mutagénesis por PCR porque altas concentraciones aumentan la tasa de error en la síntesis de ADN.

Ponte a prueba

Fundamentos y Aplicaciones de la PCR

1. A continuación, se muestran las secuencias de una molécula bicatenaria de ADN (ADN molde) y de dos cebadores utilizados para amplificar una región de ella. Resuelve las siguientes cuestiones:

a) Empareja cada cebador con su secuencia diana en el ADN molde.

b) Indica cuál es el cebador F y cuál es el R.

El cebador F es el cebador forward (hacia delante), y el R es el reverse que es el que sintetiza la cadena complementaria. En este caso, el cebador uno es el F y el cebador dos el R.

c) ¿Cuántos pares de bases tendrá el amplicón? 20 pares de bases (cada primer tiene 20).

d) Marca el amplicón en la molécula del ADN molde. Producto generado por amplificación de ADN en una reacción en PCR usando un par de primers o cebadores. Sería unir los dos.

ADN Polimerasas Termoestables en PCR

2. Sobre las ADN polimerasas termoestables:

a) Indica las dos características principales que debe tener una ADN polimerasa para que se pueda utilizar en PCR y explica por qué.

Una ADN polimerasa utilizada en PCR debe tener dos características principales: termoestabilidad y actividad de cadena. La termoestabilidad permite que la enzima sobreviva a las altas temperaturas del proceso de PCR, mientras que la actividad de cadena permite la síntesis eficiente de la cadena complementaria de ADN durante la amplificación. Estas características son cruciales para el éxito de la reacción, ya que la PCR implica ciclos repetitivos de desnaturalización y síntesis a temperaturas elevadas.

b) Explica la diferencia entre una ADN polimerasa con actividad correctora y otra sin actividad correctora.

La ADN polimerasa con actividad correctora, también conocida como ADN polimerasa de corrección de pruebas (o exonucleasa), tiene la capacidad de revisar y corregir errores durante la replicación del ADN. Por otro lado, una ADN polimerasa sin actividad correctora no posee esta capacidad de corrección de pruebas. Esto significa que, durante la replicación del ADN, no puede detectar ni corregir errores que puedan ocurrir en la síntesis de la cadena complementaria.

c) Una ADN polimerasa tiene una temperatura óptima de polimerización de 42ºC y mantiene su actividad tras dos horas a 100ºC. ¿Puede usarse esta enzima en PCR? Razona la respuesta.

La PCR implica ciclos de calentamiento y enfriamiento, y la capacidad de la enzima para resistir altas temperaturas, como 100ºC, es esencial para permitir la desnaturalización del ADN en la fase de amplificación. Además, la temperatura óptima de polimerización de 42ºC indica que la enzima es activa a la temperatura requerida durante la extensión de los fragmentos de ADN durante la PCR.

Componentes de una Mezcla Estándar de PCR

3. Haz una lista con los componentes de una mezcla estándar de PCR y explica la función de cada uno de ellos en la reacción

ADN molde: Contiene la región de ADN que se va a amplificar.
Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs): Van a componer las nuevas cadenas de ADN durante la replicación.
Dos cebadores (o primers): Oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre 6-40 nucleótidos (normalmente de 18-22), que son reconocidos por la polimerasa permitiendo iniciar la reacción. Deben estar situados enfrentados y a no mucha distancia (no más de 4 kb). Delimitan la zona de ADN a amplificar.
ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70ºC (la más común es la Taq polimerasa): Cataliza las síntesis de nuevas cadenas de ADN.
Iones divalentes: Se suele usar magnesio (Mg²⁺), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl₂), o algún otro catión divalente. También se puede emplear manganeso (Mn²⁺), para mutagénesis de ADN mediante PCR, ya que altas concentraciones de Mn²⁺ incrementan la tasa de error durante la síntesis de ADN. Actúan como cofactores de la polimerasa.
Iones monovalentes: Como el potasio.
Una solución tampón: Que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.