Fundamentos y Aplicaciones de la Electroforesis en Geles de Poliacrilamida

Fundamentos de la Electroforesis

La electroforesis es la técnica de separación de moléculas al ser sometidas a un campo eléctrico, provocando que estas migren a distintas velocidades según su tamaño y carga.

Factores que influyen en la movilidad electroforética

• pH del medio.
• Tamaño molecular.
• Naturaleza del medio de soporte.

Comportamiento de las moléculas según el pH

La carga neta de una molécula depende del pH del medio:

• A pH bajo: Las cadenas laterales adquieren carga positiva y migran hacia el cátodo (electrodo negativo).
• A pH alto: Las cadenas laterales adquieren carga negativa y migran hacia el ánodo (electrodo positivo).
• Punto Isoeléctrico (pI): Es el pH en el cual la molécula posee una carga neta de cero y, por lo tanto, no presenta movilidad electroforética.

Geles de Poliacrilamida (PAGE)

Utilizados para la separación de proteínas, ADN, ARN y fragmentos moleculares. Se presentan en dos formatos:

• Tubos: Formato tradicional.
• Placas: Permiten correr varias muestras simultáneamente.

Electroforesis discontinua

Se denomina así porque el sistema utiliza un pH discontinuo. Consta de dos regiones:

• Gel espaciador: Posee una menor concentración de poliacrilamida (poro más grande), menor fuerza iónica y un pH distinto al gel separador. Esto permite que las moléculas se desplacen con mayor velocidad debido a la mayor resistencia eléctrica.
• Gel separador: Donde ocurre la resolución final de las bandas.

Detección de bandas:

• Teñido por inmersión en colorante seguido de lavado exhaustivo.
• Medición de actividad enzimática (si la proteína es una enzima).
• Autorradiografía o fluorografía (si la mezcla es radiactiva).

Usos: Determinación de la pureza de una proteína y resolución de componentes en mezclas complejas.

Geles de Poliacrilamida en Condiciones Desnaturalizantes (SDS-PAGE)

Esta técnica utiliza un detergente de carga negativa (SDS) al 1%, pH cercano a neutro y 0.1% de β-mercaptoetanol:

• Las cadenas son disociadas por el SDS.
• Los puentes disulfuro (S-S) se rompen con el β-mercaptoetanol.
• La carga intrínseca de los aminoácidos es enmascarada por el SDS, haciendo que la movilidad sea proporcional al número de enlaces peptídicos (peso molecular).

Relación de migración: La movilidad aumenta con pesos moleculares decrecientes (distancia de migración vs. logaritmo del peso molecular). Los geles SDS permiten separar cualquier proteína, independientemente de su solubilidad en soluciones acuosas.