Fermentación butanodiolica

PRACTICA N° 7: METABOLISMO BACTERIANO

*Introducción

La identificación bacteriana inicial puede realizarse mediante la determinación de las carácterísticas de las colonias y morfología con tinción de Gram u otras coloraciones. Sin embargo, la caracterización final de un aislamiento bacteriano desconocido, para identificarlo a nivel de género y especie se lleva a cabo estudiando ciertos sistemas enzimáticos que son únicos para cada especie y sirvan como marcadores de identificación.

En el laboratorio, estos sistemas enzimáticos se detectan inoculando una pequeña porción de la colonia bacteriana aislada en una serie de medios de cultivo que contienen substratos específicos e indicadores químicos que permiten detectar cambios del pH o la presencia de subproductos específicos.

I.Acción SOBRE LOS CARBOHIDRATOS

Por definición, la fermentación es un proceso metabólico de oxido- reducción que ocurre en un medio ambiente anaerobio, y en lugar de oxígeno, un substrato orgánico sirve como el aceptor final de hidrógeno (electrones). Este término de fermentación se refiere a la utilización de hidratos de carbono como la glucosa los cuales les servirán como fuente de energía y carbono.

Las bacterias se diferencian por los hidratos de carbono que utilizan, los tipos y cantidades de ácidos mixtos producidos, dando como resultado la acidificación del medio, el cual es visible por el cambio de color en el medio de cultivo de fermentación (pH- indicador); la presencia de gas (CO2 e H+) se manifiesta por la presencia de burbujas o rotura del medio sólido.

A)REACCIONES DE OXIDACIÓN- FERMENTACIÓN DE AZUCARES:

•EN MEDIO TSI (Triple Sugar Iron)

EL medio TSI fue diseñado para la diferenciación de Bacilos Gram negativos, basándose en la capacidad potencial de estas bacterias para fermentar carbohidratos y producir sulfuro de hidrógeno (H2S).

El medio contiene tres azúcares: glucosa, lactosa y sacarosa en proporciones de 1:10:10 respectivamente. Para detectar los productos ácidos generados se emplea un indicador de pH que es el rojo de fenol cuyo rango de viraje está entre pH 8.4 (rojo) y pH 6.8 (amarillo).

Los patrones de comportamiento de los bacilos Gram negativos ante los carbohidratos presentes en este medio pueden ser fundamentalmente tres:

1.Fermentación de glucosa únicamente

2.Fermentación de glucosa + lactosa, glucosa + sacarosa o glucosa + ambos carbohidratos

3.No fermentación de carbohidratos

Como producto de la fermentación de los diferentes carbohidratos se puede formar gas, que se detecta como pequeñas burbujas o grietas en el medio o por desplazamiento del mismo hacia arriba del tubo.

El medio tiene incorporado tiosulfato de sodio como fuente de azufre para generar H2S, y sales de hierro que al reaccionar con el gas forman un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso (FeS).

MATERIAL

-Tubo con medio TSI en plano inclinado.

-Cepas control: E. Coli,  S. Aureus,  Ps. Aeruginosa

PROCEDIMIENTO

1.Con el asa de siembra inocule una porción pequeña de la colonia en el centro del tubo y estríe la superficie del pico de flauta.

2.Rotular e incubar a 37°C por 18- 24 horas

Interpretación

Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubación indicada.

1.Producto de H2S: Ennegrecimiento en el fondo del tubo

2.Fermentación de la glucosa únicamente:

(rojo/amarillo), esto se debe a que la glucosa (que se encuentra en baja concentración con respecto a los otros azúcares), ha sido utilizada y la cantidad de ácido producido no es suficiente para neutralizar los productos alcalinos generados por la utilización de la peptona; además los ácidos pueden ser utilizados.

Estos procesos, que son oxidativos, ocurren en la superficie del medio, mientras que enel fondo, por no estar en contacto con el oxígeno, sólo hay fermentación y el medio permanece ácido.

3.Fermentación doble o triple de carbohidratos:(

Amarillo/amarillo).La fermentación de la glucosa y alguno (o ambos) de los otros dos azúcares produce gran cantidad de ácidos, por lo que el tubo permanece amarillo.

4.No fermentación de carbohidratos:(rojo/anaranjado). Se presenta únicamente utilización oxidativa de peptonas, por lo que sólo la superficie del tubo se alcaliniza.

5.Producción de gas: Formación de burbujas (CO2 e H+), grietas o desplazamiento del medio

B)Producción DE Ácidos Y ACETIL- METIL- CARBINOL (Acetoina)

1. PRUEBA DEL ROJO DE METILO ( RM ) 2

La prueba de Rojo de metilo es una prueba cuantitativa que proporciona una carácterística valiosa para identificar especies bacterianas que producen ácidos fuertes (láctico, acético, fórmico) a partir de glucosa.

Estas bacterias que primariamente siguen la vía de fermentación de ácidos mixtos frecuentemente producen suficiente ácido después de una incubación prolongada, como para mantener un pH por debajo de 4.4 (el punto ácido límite del indicador rojo de metilo), superando el sistema amortiguador del pH del medio.

2. PRUEBA DE VOGES PROSKAUER ( VP )

El ácido pirúvico, un compuesto fundamental formado en la degradación fermentativa de la glucosa, es metabolizado por algunos microorganísmos produciendo el acetil- metil- carbinol(Acetoina)un subproducto neutro de la vía 2,3- butilenglicol.

La prueba se basa en la conversión del acetil- metil- carbinol en diacetil a través de la acción del KOH y Oxígeno atmosférico. El diacetilo es convertido en un complejo rojo bajo la acción catalítica del Alfa naftol y Creatinina.

MATERIALES

--Cepa bacteriana MR positivo y negativo

--Cepa bacteriana VP positivo y negativo

--Reactivo Rojo de metilo