Que es un fenómeno luminoso

1. Espectrofotometría se basa en la medida de la energía radiante emitida absorbida transmitida dispersada y reflejada por un preparado de laboratorio cuando sobre el incide la citada energía

La energía radiante se obtiene a partir de una fuente luminosa o calorífica una lámpara llama o reacción química estás técnicas se agrupan bajo la denominación de fotometría

Engloba los siguientes métodos:

Fotometría de absorción nuclear ( visible y ultravioleta)

Fotometría de luminiscencia ( emisión de luz o fluorometría  y quimioluminiscencia)

Fotometría de dispersión ( turbidimetría y nefelometría)

Fotometría de emisión de llama

Fotometría de absorción atómica

Fotometría de reflexión

Técnicas espectrométricas

Interacción radiación muestra

 transmisión. Se produce cuando la reducción incide sobre la sustancia y no se produce pérdida de energía ni cambio de dirección

absorción. Se produce cuando existe una pérdida de intensidad de la radiación al atravesar la sustancia punto las moléculas o partículas que absorben la radiación ganan energía y están en un estado excitado

emisión. Se produce cuando las moléculas o átomos en estado excitado liberan su energía y vuelven a su estado de reposo

dispersión. Reproduce cuando la radiación choca contra una partícula en suspensión y cambia de dirección sin variar su energía

refracción punto el haz de radiación al atravesar la solución se desvía o cambia de dirección por la diferente naturaleza del medio de propagación

reflexión. El haz de luz incide sobre una superficie y se produce un efecto de rebote y cambio de dirección

difracción junto el haz de luz se desvía al pasar por el extremo de una superficie o al atravesar una rendija

Todas las técnicas fotométricas tienen su fundamento en las interacciones de las radiaciones electromagnéticas

 la rem es una forma de energía radiante que tiene propiedades ondulatorias

 longitud de onda. Es la distancia existente entre dos picos consecutivos de un ciclo completo del movimiento ondulatorio se mide en  nanómetro

 frecuencia. Es el número de ciclos completos por unidad de tiempo es inversa a la longitud de onda punto la frecuencia se expresa en ciclos por segundo o hercios  un hercio es igual a un ciclo

 energía. La energía de un fotón cualquiera viene definida por su frecuencia. Las longitudes más cortas poseen mayor energía que las longitudes de onda más largas.

 espectro electromagnético(EEM)

 se denomina al espectro electromagnético al conjunto Derren que existe en nuestro entorno bicho espectro incluye desde rayos gamma hasta ondas de radio este espectro se ha dividido en varias regiones en función de las longitudes de onda que lo componen rayos gamma rayos X ultravioleta visible  infrarojo microondas ondas de radio

La regíón visible del espectro es la zona de longitudes de onda a cuya energía responde el ojo humano está formada a sube por las siguientes subregión:

 Violetta  340 a 425 nanómetros.

 azul  425 a 490 nanómetros

 verde 490 a 575 nanómetros

 amarillo 575 a 885 nanómetros

 naranja 585 a 650 nanómetros

 rojo 650 a 700 nanómetros

 la luz blanca es la suma de todas las reducciones correspondientes a la zona visible del espectro.

 espectrofotometría de absorción molecular

 definición

 un método que mide la concentración de un analito basándose en la capacidad de dicho analito para absorber luz de una determinada longitud de onda al ser excitado por una REM recordamos que la REM es la radiación electromagnética.

 cuando esté haz de luz incide sobre la muestra problema he estado  absorbe radiación de una determinada longitud de onda, el resto de las redacciones serán transmitidas y aparecerá a la vista un color que es la suma de las longitudes de onda que no han sido absorbidas, a este color se llama color complementario.

 la luz ultravioleta y la infrarrojo  también sufren  el fenómeno absorción pero al no encontrarse dentro de la zona zona visible del espectro el resultado no es un color complementario captable.

 el proceso de absorción

  existen  moléculas o partes de moléculas que al interaccionar con la radiación electromagnética al suelo en parte de su energía y experimentan saltos en sus electrones desde unas órbitas a otras más alejadas del núcleo a esto lo llamamos excitación a estas moléculas se le denominan especies absorbentes o cromóforos o cromogenos en el proceso de absorción de una red generaría un color.

 cuando una partícula de estas carácterísticas se encuentra en estado de reposo eh interacciona con el haz de luz absorbe la energía y pasa a un estado excitado la partícula en estado excitado tiende a regresar a su estado de reposo  desprendiendo la energía absorbida en forma de calor

 cada especie absorbente ( Cromóforo  o cromógeno) tiene lo que se llama un espectro de absorción carácterístico, este espectro representa la relación existente entre longitud de onda de la red y la absorción que representa la disolución problema que contiene el cromógeno.

 los espectros de absorción son de utilidad tanto para seleccionarlo longitud de onda más adecuado para una medida fotométrica que sería una determinación cuantitativa y también para fines de identificación de una sustancia que sería una determinación cualitativa.

 transmitancia y absorbancia:

 cuando un haz de luz incide sobre una cubeta que contiene una solución capaz de absorber en de una determinada longitud de onda el haz de luz resultante tendrá una intensidad menor de salida que la que tenía de entrada a esto se le define como transmitancia, la relación existente entre la intensidad de luz incidente y de la luz resultante o transmitida.

 dicha transmitancia tiende a expresarse en porcentaje variando sus valores entre 0 y 100 en función de que la solución absorba toda la luz incidente o no absorba nada en absoluto.

 en los fotometros que se utilizan actualmente las lecturas de tantos por ciento pueden ser transformadas en absorbancia y presentadas así al operador pero hay que tener en cuenta que la absorbancia en sí misma no es una cantidad  medibles le sino que se obtiene por el cálculo matemático a partir de la transmitancia medida por el sistema fotométrico.

Si se representa gráficamente en un eje de coordenadas la relación existente entre la transmitancia y la concentración del analito medido se obtiene una curva que muestra la relación inversa es decir que cuando aumenta la transmitancia disminuye la concentración.

 ley de Lambert beer

 está ley relaciona el grado de absorción de la disolución con la concentración del absorbente el analito y la longitud del trayecto que la app de luz recorre a través de la disolución

  el coeficiente de absorción es carácterístico de cada sustancia, bicho coeficiente es constante para cada sustancia ya que se fijan las condiciones de longitud de onda pH y temperatura. Si el coeficiente es alto en medio analítico detectará concentraciones menores de sustancia buscada lo que aumentará la sensibilidad.

 la ley de Lambert beer una aplicación práctica y nos permite determinar método a partir de los cuales averiguamos la concentración de una sustancia de interés en una disolución, basándonos en la relación lineal existente entre la solvencia y la concentración podremos conocer esta última dedos formas:

 por comparación con una dilución de  parámetros conocidos o también llamada patrón

 por transposición a una curva de calibración qué es la representación gráfica en un eje de coordenadas de la absorbancia frente a la concentración.

 debemos conocer un parámetro denominado linealidad qué es el intervalo de concentraciones del cromógeno entre las cuales existe una relación lineal concentración absorbancia. Cuando la concentración del cromógeno en la disolución sobrepasa los límites de la linealidad la ley de Lambert-Beer deja de cumplirse también hay que tener en cuenta que si no está dentro de los límites de linealidad ya sea por dilución mayor o menor tampoco se dará está ley.

 limitaciones de la Ley de Lambert beer

existen una serie de circunstancias en la que la ley de Lambert-Beer no se cumple estas son:

 cuándo se emite en concentraciones muy elevadas de cromógeno

 cuando la radiación incidente no es monocromática

 cuándo existe luz errática o dispersa

 cuando los lados de la cubeta no son paralelos

 cuando existen interferencias por otros cromogenos

 cuando el cromógeno emite fluorescencia

 cuando la farmacia del solvente es significativa respecto a la del soluto

 el espectrofotómetro:

 es el instrumento que se utiliza para las medidas de absorción de las REM

 existen distintos tipos de aparatos en la medida de la absorción según el sistema selector de longitud de onda pueden ser:

 colorímetro o fotómetro:  qué emplean filtros de vidrio o de interferencia y obtienen luz monocromática en longitudes de onda.

 espectrofotómetro: qué emplean monocromadores que son prismas o redes de difracción y obtienen luz monocromática en un intervalo continuo de longitudes de onda

 la diferencia entre uno y otro es que el fotómetro o colorímetro obtiene la luz monocromática a longitudes de onda discretas asaltos mientras que el espectrofotómetro tiene una luz monocromática en un intervalo continuo de longitudes de ondas.

 componentes de un espectrofotómetro:

 constan de:

 fuente estable de energía radiante, rejillas de entrada y salida, selector de longitud de  onda, cubetas para la muestra, detector de energía radiante  y medidor de datos.

 fuente de energía radiante:

 es el emisor de radiación electromagnética emite una banda muy amplia de radiaciones continuas alrededor de la longitud de onda deseada, según la zona del espectro que emite hay tres tipos:

 visible: la más utilizada para las medidas de la regíón visible del espectro es la lámpara de tungsteno también se pueden utilizar lámparas halógenas y también fuentes de luz láser.

 ultravioleta: para las medidas en la regíón ultravioleta se utilizan lámparas de descarga de hidrógeno.

 infrarrojos: se utilizan fuentes especiales de óxidos de tierras raras.

rejillas:

 la rejilla de entrada pretende reducir al máximo la luz difusa y evitar que la luz dispersa entre en el sistema selector de longitud de onda.

 la rejilla de salida tiene como función evitar que la luz difusa atraviese la cubeta, ambas intentan conseguir unas de luz paralelo, en el caso que la fuente de luz fuese láser no se necesitarían.

 sistema selector de longitud de onda:

 se puede seleccionar por medio de filtros o monocromadores.

 los filtros son los sistemas más simples ya está formado por materiales que dejan pasar de forma selectiva las longitudes de ondas deseadas absorbiendo el resto suelen ser de vidrio coloreado.

 los monocromadores pueden ser prismas normalmente de vidrio o cuarzo qué son capaces de descomponer la luz en todas las longitudes de onda o también se puede utilizar las redes de difracción qué es una placa metálica con forma de red por la que cada surco que tiene actúa como un pequeño prisma.

los filtros de vidrio tiene una amplitud de banda de 50 nanómetros, los de interferencia de 5 a 10 nanómetros, los prismas de 05 a 1,5 nanómetros y las redes de difracción de menos de 0 o 5 nanómetros. En el caso de que utilizaremos luz láser no sería necesario los sistemas selectores de longitud de onda ya que emiten con una amplitud de banda menor a 0,1 nanómetro.

 cubetas:

 son los recipientes dónde se colocan las soluciones para las medidas de absorbancia suelen ser cuadradas o rectangulares o redondas y se construyen en vidrio plástico cuarzo, las de vidrio son útiles para las medidas entre 340 y 1000 nanómetros las de plástico entre 310 y 1000 nanómetros, para lecturas por debajo de 310 nanómetros que sería la regíón ultravioleta se utilizarían las cubetas de cuarzo. Las más utilizadas son de un centímetro.

 detectores de energía radiante

 sistemas que convierten la energía luminosa que les llega energía eléctrica corrientes de electrones. Los más utilizados son las células fotovoltaicas o de barrera y los tubos fotomultiplicadores estos últimos no tienen efecto fatiga

 medidores de datos:

 la señal eléctrica general por el director se lleva hasta el dispositivo de Ecuador qué refleja su valor numéricamente.

 manejo del fotómetro de absorción:

  se conecta el aparato a la red y se enciende la lámpara es necesario un tiempo de espera después seleccionamos la longitud de onda deseada, realizaríamos un blanco con el objeto de eliminar interferencia y para ello ajustamos a cero la absorbancia, después me diríamos la absorbancia de patrones y muestra y por último apagar  la lámpara y desenchufar el aparato

 si la medición espectrofotométrica se hace con luz ultravioleta recordamos que no es visible no podemos basar la en su absorción por una solución  coloreada chino en otro principio existen sustancias como el NAD o  el NADP  que no pueden ser absorbidas a 340 360 nanómetros, cuando estás sustancias son reducidas a quieren capacidad absortiva si hacemos participar al analito buscando una reacción química en la que se produzca el paso  NAD NAPD a NADH NAPDH Se producirá una absorbancia mayor si por el contrario utilizamos una reacción química NADH NAPDH a NAD NADP Absorbancia experimentar una disminución directamente relacionada con la concentración del analito.

Tipos de medidas espectrofotométricas:

 existen tres grandes variantes a la hora de realizar una medida con el espectofotometro, las medidas a punto final, las medidas a dos puntos y las medidas cinéticas

 medidas a punto final transponer en contacto patrón y muestra con los reactivos correspondientes y esperar a que tengan lugar la formación del cromógeno se procede hacer una única factura de absorbancia y a transformar el valor obtenido en la concentración utilizando el factor de calibración o la curva

 patrón muestra color absorción

 medidas a 2 puntos: supone la realización de dos medidas de absorbancia A1 y A2 separadas por un intervalo determinado de tiempo dichas medidas se hacen sobre la muestra y sobre el estándar

 se mide la interferencia

 medidas cinéticas: se utilizan especialmente determinaciones de enzimas con luz ultravioleta en ella se mide la variación de la absorbancia en la solución problema conforme va teniendo lugar la reacción química en la que está implicada la enzima se toma 45 medidas a intervalos de tiempo constante cada 20 o 60 segundos y se calcula la media de las diferencias existentes entre las distintas absorbancias obtenidas la multiplicación de este valor por un factor determinado da directamente la concentración del analito. No se necesita de blanco ni de patrón.

 interferencia en las determinaciones espectrofotométricas:

  la corrección puede hacerse por eliminación del producto indeseado, pero existen otros métodos como puede ser la utilización de un blanco o blanco de muestra otra forma de corregir las interferencia es recurrir a métodos cinéticos hay que recordar que los Mateos cinéticos eran los que se tomaban cuatro o cinco medidas a intervalos de tiempo constantes.

 espectrofotometría de absorción molecular infrarroja:

 la absorción molecular de redacciones de esta zona del espectro reproduce transiciones vibracionales y rotacionales, las bandas de absorción son muy estrechas y corresponden a enlaces muy específicos ya menudo dependen de los autónomos más próximos un espectro infrarroja es como una huella dactilar de la molécula y esto implica que es una técnica idónea para identificar compuestos orgánicos o inorgánicos puros pero no es adecuada para cuantificar.

 los instrumentos más utilizados son espectrofotómetros IR

 espectrofotometría de luminiscencia:

 es una técnica espectroscopia de emisión molecular muchísimo más sensible que las técnicas de absorción.

 la emisión de luz se produce por acción de un agente externo que excita las moléculas del material problema dicha citación hace que la absorben la energía procedente de ese agente externo y experimente el Santos orbitales en sus electrones alcanzando el estado excitado cuando las moléculas se liberan de exceso de energía emiten un fotón de luz a este fenómeno se le llama luminiscencia y Gmail no existe ni perdida ni ganancia de calor.

radiación luminosa:

- foto luminiscencia: - fosforescencia y fluorescencia

- reacción química: - luminiscencia/ bioluminiscencia

- electricidad: electro luminiscencia

 fotometría de fotoluminiscencia o de emisión de luz: flujometría

 es un método que mide la concentración de un analito en una muestra basándose en la capacidad de dicho analito para emitir luz fluorescente al ser citado por una rem luminosa

 proceso de emisión:

 determinados compuestos químicos tiene la propiedad de tras ser excitados por una REM y experimentar los saltos electrónicos son capaces de retornar a su estado de reposo produciendo una energía de tipo luminoso a este tipo de compuestos químicos  se les denomina fluoroforos.  la luz emitida por el compuesto tiene una longitud de onda mayor que la luz incidente y por tanto posee una energía menor.

 el fenómeno de emisión es más lento que el de absorción.

 la luz fluorescente emitida se puede utilizar para cuantificar la concentración del compuesto que la emite ya que dicha concentración y la intensidad de la emisión fluorescente se puede relacionar mediante la Ley de Lambert-Beer para conseguir esta relación directa debemos trabajar con soluciones problema muy diluidas.

 el flúorímetro:

 para la medición de la fluorescencia se emplean flúorímetro yEspectrofluorímetro, el flúorímetro utilizara filtros de vidrio, mientras que el espectrofluorímetro  hará uso de monocromadores ( prisma o redes de difracción)

 poseen los siguientes componentes:

 fuente de energía radiante

 rendijas  excitación o de entrada y  emisión o salida

 selectores de longitud de onda  excitación y emisión

 cubeta

 detector de energía radiante

 medidor

 fuente de energía radiante suelen utilizarse lámparas de arco de xenón que emiten luz de alta intensidad en un espectro amplio de 200 a 600 nanómetros

 rendija: son similares a las de los espectrofotómetros la única diferencia es que la de emisión o salida está situada formando un ángulo de 90 grados.

 selectores de longitud de onda: existen 21 situado tras la rejilla de entrada y otro delante de la rejilla de salida el primero sirve para seleccionar los longitud de onda que será absorbida en mayor medida por el analito y el segundo pretende eliminar las fluorescencias parasitarias emitidas desde la  cubeta.

 cubeta: son generalmente de sílice o de cuarzo

  medidores: no se diferencian de los utilizados en la espectrofotometría salvo en la posición.

 de esta manera los flúorímetro se diseñan de manera que el selector de emisión la rejilla de salida y el detector se colocan formando un ángulo de 90 grados con respecto a la fuente de emisión.

 la ventaja más importante de la fluorometría es su enorme sensibilidad la sensibilidad es la capacidad para detectar pequeñas cantidades de Nolito, que puede llegar a ser entre 100 y 1000 veces superior a la espectrofotometría.

 aplicaciones de la fluorometría:

se aplica normalmente a sustancias que se encuentra en la muestra en pequeña cantidad debido a la ante alta sensibilidad del método cómo pueden ser hormonas enzimas fármacos drogas etcétera

 actualmente la aplicación de la furgoneta ya se basa en asociación a una reacción antígeno anticuerpo.

fotometría de quimioluminiscencia:

 es un método que mide la concentración de un analito en la muestra basándose en la capacidad de dicho analito para emitir luz al ser editado por la energía procedente de una reacción química, esta tiene lugar cuando la molécula emite un fotón como resultado de su participación en una reacción química mediante esta he llevado un estado excitado y retorna a su estado de reposo emitiendo luz, esta se realiza sin perdida ni ganancia de calor la electro quimioluminiscencia  se emplea actualmente en este caso es generada electroquimicamente en la superficie de un electrodo.

 fotometría de emisión atómica fotometría de llama:

 es un método que mide la concentración de un analito en la muestra basándose en la capacidad de bicho analito para emitir luz de una determinada longitud de onda al ser excitados con una llama, es utilizada para determinaciones de iones de metales alcalinos en líquidos biológicos, especialmente sodio,  potasio y litio. En la actualidad se están sustituyendo por técnicas más sencillas.

Fotómetro de llama:

 se basa en el fenómeno de emisión pero la lámpara se estudia sustituye por la llama no existe cubeta para la muestra, los elementos que constituyen este aparato son:

 gases

 aspirador- diluidor- atomizador

 quemador

 componentes fotométricos: rejilla de entrada y salida, selector de longitud de onda, detector de energía radiante y medidor de datos.

 gases: pueden emplearse el gas natural butano propano mezclados con un agente oxidante como el oxígeno

 aspirador-  diluidor- atomizador:  en diluidor se encarga de influir la muestra de 100 a 200 veces para disminuir la viscosidad de la proteína, el atomizador convierte la muestra en gotas microscópicas para que puedan ser excitadas por la llama.

 quemador: la parte del fotómetro donde las botitas de muestra son excitadas por la llama.

 componentes fotométricos: son aquellos como la rendija selectores de longitud de onda detectores o medidor es que son iguales a los del resto de las técnicas fotométricas.

fotometría de llama directa y con estándar interno:

 pueden ser de dos tipos diferentes directos y con estándar interno:

 directo: se emplean directamente la intensidad de la luz emitida por el analito como medida de su concentración

 con estándar interno: la intensidad de emisión luminosa Asturias se compara con la de un elemento agregado que toma el nombre de estándar o patrón interno, fotómetro de llama utilizados en clínica son de este tipo

 fotometría de absorción atómica:

 es un método que mide la concentración de un analito en una muestra basándose en la capacidad de dicho analito para absorber la luz de la misma longitud de onda que emitiría si estuviese citado, está técnica es utilizada para determinaciones de metales del tipo del calcio, magnesio, cobre, lomo etcétera en líquidos biológicos.

 está basada en el fenómeno de absorción de luz, el elemento a estudiar es situado en una llamada dónde es disociado de sus enlaces químicos y por ganancia o pérdida de electrones se sitúa en estado fundamental el estado fundamental es no es citado ni ionizado en estas condiciones el átomo es capaz de absorber la luz emitida por las fuentes radiación electromagnética construida del metal a medir que por tanto emite las líneas del espectro carácterístico de este.

 el sistema fotométrico mide la cantidad de luz que es absorbida por la nube atómica en la que se encuentran los átomos en estado fundamental, mide la atenuación de la luz incidente a su paso por la nube atómica como consecuencia de las interacciones de los fotones con los átomos en estado fundamental a medida que el número de átomos en estado fundamental del elemento a medir se incrementa también lo hace la cantidad de luz absorbida y esto permite conocer la concentración del analito en la muestra.

El fotómetro de absorción atómica:

 los elementos constituyentes de un fotómetro de absorción atómica son los siguientes:

 fuente de luz. Lámpara de cátodo hueco.

 gases.

 quemador.

 componentes fotométricos:

 - rejillas de entrada y salida

- selector de longitud de onda

- detector de energía radiante

- medidor de datos

* lámpara de cátodo hueco: es la fuente de luz está diseñada para emitir líneas de espectro carácterístico de un elemento dado por ello se utilizan lámparas específicas según el elemento a medir el interior de la cápsula existe un gas inerte que puede ser uníón o argón y un cátodo del mismo material que el que se quiere medir. Cuando se aplica un alto voltaje a través del ánodo y el cátodo los átomos de metal en el cátodo se cita en el produce una luz una determinada  longitud de onda qué es carácterísticas del elemento a medir

* gases: se utilizan los mismos que la fotometría de llama, acetileno más aire

* aspirador- atomizador: tiene funciones parecidas que en el fotómetro de llama.

* quemador: pretende situar a los átomos a medir en estado fundamental. La función de las llama es transformar la solución es analizar en átomo en estado gaseoso.

* componentes fotométricos: las rendijas, selectores de longitud de onda y los detectores medidores son iguales al de los resto de las técnicas fotométricas y tienen la misma función.  cómo diferencia quizás hay que decir que los sistemas selectores de longitud de onda tienen que ser del tipo de red de difracción y poseer un paso de banda muy estrecho, los detectores empleados suelen ser del tipo de fotomultiplicadores.

 existe una variante en el fotómetro de absorción atómica que utiliza llama para conseguir la nube de átomos en estado fundamental está llamado  es reemplazada por un horno de grafito te aporta mayor sensibilidad este aparato se utiliza para una determinación de metales pesados como el plomo

  espectrofotometría de dispersión:

 es un método que mide la concentración de un analito en una muestra basándose en la capacidad de dicho analito para dispersar el paso un rayo de luz incidente

 fenómeno de la dispersión:

 este fenómeno se produce al colisionar una radiación monocromática con una suspensión de partículas por lo que se induce a cada una de ellas a un cambio de energía vibracional de sus moléculas sin que afecten a los niveles energéticos de sus electrones como consecuencia las moléculas se convierten a su vez en una nueva fuente de energía que emite radiación en todas las direcciones del espacio, esta radiación emitida por la partícula se  denomina dispersan y es de la misma longitud qué  la radiación incidente.

 los fenómenos de dispersión de luz dependen de los siguientes factores:

 tamaño peso molecular y concentración del analito medido longitud de onda de la luz incidente y distancia del detector a la cubeta:

 en función del tamaño de la partícula la luz incidente experimenta diversos modelo de dispersión lo que determinará el tipo de medida a realizar qué puede ser turbidimetría o nefelometría.

 venta en ciudad de la luz dispersada es directamente proporcional a su concentración en la solución problema

 medición de la luz dispersa:

 puede hacerse mediante dos métodos analíticos diferentes la Turbidimetría y la nefelometría

turbidimetria:  se utiliza para solucionar problemas formadas por partículas relativamente grandes. Consiste la medida de la disminución de la intensidad de un haz de luz incidente cuando pasa a través de una suspensión de partículas con capacidad para dispersar el alta de luz.

 nefelometría: se utiliza para soluciones problemas formadas por partículas de menor tamaño especialmente complejos antígeno-anticuerpo. Consiste en la medida de la intensidad de la luz dispersa de un incidente cuando traviesa una suspensión de partículas, dicha desviación se mide en ángulos distintos al de incidencia.

turbidímetro/ nefelómetro:

 independientemente de que miramos transmitancia dispersión de luz en instrumento utilizado se compone de los mismos elementos hay que tener en cuenta que están dispuestos de forma diferente:

 fuentes de energía radiante

 rejilla

 selector de longitud de onda

 cubeta

 rector de energía radiante

 medidor de datos

 fuente de energía radiante: se emplean diferentes tipos de lámparas de Mercurio de xenón o láser esta última es la mejor ya que genera haces de luz estables y de longitud de onda precisa.

 rejillas: su función es conseguir que las de luz que incide en la muestra sea paralelo

 selector de longitud de onda 2 puntos puede ser del tipo de los filtros o de los monocromadores, no es necesario cuando la fuente de luz es láser

 cubeta: se emplea los mismos tipos que en la técnica de espectrofotometría.

 detector: se emplean sistemas similares a los vistos en técnicas anteriores la única diferencia Cira que la nefelometría se utilizara un ángulo diferente de un 10 a un 90 grados

  interferencias:

 tanto en los reactivos como en el suero pueden existir partículas que produzcan una dispersión de luz no deseada. Es el caso de las lipoproteínas, podemos solucionar el problema precipitando las proteínas o trabajando con longitudes de onda que no interaccionen con las mismas.

 espectroscopia de masas( ms)

 es una técnica analítica que permite estudiar compuestos de naturaleza diversa y os tenemos una información cuantitativa y cualitativa, es posible mediante está técnica obtener información de la masa molecular del compuesto analizado así como obtener información estructural del mismo o podemos detectar su presencia y cuantificar su concentración

 se basa en obtener una nube de moléculas gaseosas ionizadas de manera que los elementos químicos qué dan en  forma gaseosa, está nube se acelera mediante un campo eléctrico y pasa por un potente imán que separa los iones según su masa y finalmente choca con un detector sensible a todos los iones

 al final se obtiene una gráfica llamada espectrograma o espectro de masas con los pesos atómicos la frecuencia o cantidad en coordenadas.

 refractometria:

 es un fenómeno de desvío que despigmenta el haz incidente al atravesar una solución ocasionando por la diferente naturaleza del aire y la solución sobre el que incide, el ángulo de desvío se denomina ángulo de refracción

 se conoce como índice de refracción yo una solución a la relación entre la velocidad de la luz en el aire y la velocidad de la luz a su paso por esta solución, su valor es proporcional a la cantidad de sustancias disueltas en la misma, se puede calcular la concentración de soluto en una solución midiendo su índice de refracción.

 fotometría de reflectancia. Química seca

Está técnica está basada en la reflexión de la luz, la cual se produce cuando una de luz incide sobre una superficie y cambio de dirección en el mismo medio. Los analizadores que se utilizan este método determina la concentración de un determinado analito basándose en esta propiedad de la luz.

 se conoce como química seca porque se emplean tiras reactivas  pon los reactivos en estado seco. Tras el contacto con la muestra se da una reacción que produce un cambio de color que puede ser medido he transformado en concentración de un determinado analito.

la osmolalidad es una propiedad de las soluciones que dependen del número de partículas presentes en ellas, cuánto mayor sea su número mayor será esta.

 los solutos disueltos modifican cuatro propiedades físicas de las soluciones llamadas propiedades coligativas qué son:

 1 presión osmótica

 2 presión de vapor

 3 punto de ebullición

 4 punto de congelación

cuando aumenta la osmolaridad de una solución se produce un descenso del punto de congelación y un aumento de la presión del vapor, se puede determinar la osmolaridad de una solución mediante un aparato llamado osmómetro, hay dos tipos de osmometros:

 osmómetro de punto de congelación

 osmómetro de presión de vapor

 técnicas de separación:

Cromatografía

 entendemos que son aquellas técnicas de separación de solutos disueltos en disolventes basadas en diferentes afinidades que muestran dichas sustancias por dos fases denominadas móvil y estacionaria.
La cromatografía es una técnica de separación que tiene su fundamento en la distinta distribución de las sustancias estudiadas en dos fases una móvil y otra estacionaria.

 al aplicar está técnica la fase móvil empuja dicha mezcla a través de la fase estacionaria de tal forma que aquellos componentes que tengan más afinidad por la fase estacionaria se retrasarán soban C mientras que los componentes que tengan poca afinidad la atravesara en rápidamente, ver manera que cada uno de los componentes progress a lo largo de la fase estacionaria con una velocidad distinta. Los componentes de la muestra han quedado separados unos de otros por una serie de bandas.

 clasificación:

 se clasifican según distintos criterios en función de las carácterísticas físicas de la fase móvil o según el mecanismo físico que se lleva a cabo la separación de los frutos entre las dos fases la móvil y la estacionaria.

  en función de las carácterísticas físicas de la fase móvil hay dos grandes tipos de  cromatografía:

- cromatografía líquida: su fase móvil es un líquido

- cromatografía gaseosa su fase móvil es un gas

 según el mecanismo físico que se lleva a cabo la separación de los glúteos entre las dos fases la móvil y estacionaria y de acuerdo a esto tendríamos :

-cromatografía de absorción

- cromatografía de partición o reparto

- cromatografía de intercambio iónico

- cromatografía de exclusión molecular

- cromatografía de afinidad

 podemos clasificar las técnicas  cromatograficas de acuerdo con la forma física del aparataje:

- cromatografía soporte plano

-  cromatografía en columna

mecanismos de separación:

- absorción:

 Se utiliza en cromatografía líquidas y  y sólidas en soportes planos sin columnas y en gaseosa y sólida en columnas. Se basa en el establecimiento de interacciones de tipo electrostático puente de hidrógeno y fuerzas de van der Waals entre los lutos y las fases móvil y estacionaria,Estás interacciones permiten que los solutos se fijan en la superficie de la fase estacionaria.

 con respecto a la fase estacionaria puede estar constituida por absorbentes no polares del tipo del teflón o por absorbentes polares que podrían ser ácidos como la silica gel o básicos como la alumina. La  fase móvil( disolvente) puede estar formada por éter, tetracloruro de carbono, hacer,, benceno etanol,  o agua.

- partición o reparto:

 se utiliza en cromatografía L/L  en soportes planos y columna y G/L  en columnas, es una técnica basada en la separación de solutos por su diferente solubilidad de entre una fase móvil y una estacionaria inmiscibles entre sí.

La fase estacionaria está constituida por un soporte sólido recubierto de un líquido por eso se considera líquida y podemos distinguir dos grandes tipos de cromatografía de partición:

- cromatografía de partición en fase normal: el soporte está recubierto de un líquido de naturaleza polar mientras que la fase móvil es apolar, en esta variedad cromatografica los componentes vas por alegres de la mezcla son retenidos por la fase estacionaria con más intensidad, los de polaridad intermedia son retenidos con menos fuerza y atraviesan la fase estacionaria con mayor rapidez que los anteriores y los apolares no son retenidos en absoluto por lo que pasa por la fase estacionaria con mucha rapidez.

-Fotografía de partición en fase invertida: el soporte está recubierto por un líquido de naturaleza  apolar, mientras que la fase móvil es polar en este caso los componentes apolares son retenidos con más intensidad que los polares los componentes apolares atraviesan la fase estacionaria más lentamente que los segundos.

Intercambio iónico:

 se utiliza en cromatografía líquido sólido y se realiza en columnas dentro de las cuales van para que está da la fase estacionaria ( resinas de intercambio iónico)

 los solutos tienen carga, con carga negativa se utilizara resina  aiónica, cuando la carga sea positiva se utilizara una resina cationica.

 el fundamento de la separación de solutos es de tipo electrostático, hay una serie de interacciones electrostáticas que se producen entre los grupos ionizados de las sustancias a separar y los grupos ionizados unidos a la resina de intercambio iónico estás interacciones permiten la sustitución de unos por otros.

 las resinas de intercambio iónico puede ser cationicas que intercambian iones de la muestra con carga positiva canciones y anionicas intercambian iones de la muestra con carga negativa aniones.

 las cationicas muestran en su composición grupos fenólicos.

 las aniónicas están compuestas por grupos amino.

 podemos distinguir tres fases:  una cuando arranca la fase móvil, 2 cuando se separa la sustancia y tres cuando regeneramos la resina.

 está técnica se utiliza para la separación de iones inorgánicos como por ejemplo en la purificación de aguas y orgánicos como los aminoácidos los péptidos las proteínas etcétera.

- exclusión molecular:

 se utiliza en cromatografía líquido sólido sobre columnas en cuyo interior está dispuesto un gel de filtración formado por un material que presenta por orden determinado tamaño.

El fundamento de la separación es la diferencia en el tamaño molecular de las sustancias a separar de tal forma que cuánto menor sea este mayor retención experimenta la sustancia al atravesar el gel, las sustancias de alto peso molecular no pueden entrar en los poros del gel de filtración por lo que atraviesan la columna rápidamente cosa que no ocurre lo mismo con sustancias de bajo peso molecular que quedarán retenidas en los poros.

 las aplicaciones de esta técnica se orientan a separación de sustancias de alto peso molecular como las inmunoglobulinas proteínas ácidos nucleicos y sobre todo a la determinación de pesos moleculares.

- afinidad:

 se utiliza en cromatografía líquido sólido sobre columnas en las que existe una fase estacionaria constituida por un soporte sólido sobre el que se encuentra en ciertas sustancias( ligandos) qué muestra afinidad específica por otra.

 está técnica de separación se basa en los mecanismo de afinidad entre dos elementos enzima sustrato, hormona receptor, antígeno anticuerpo.  cuando la fase móvil atraviesa la columna las sustancias con actividad específica por los ligandos quedarán retenidas pasando los demás, los elementos retenidos pueden ser liberados luego añadiendo metabolitos de mayor afinidad por el ligando o bien cambiando las condiciones fisicoquimicas de la  fase móvil ( pH, fuerza iónica,...)

 tipos de cromatografía:

 cromatografía en soporte plano:

 se realiza de dos formas distintas: sobre papel y en  capa fina.

- cromatografía en papel: el soporte sobre el que se coloca la fase estacionaria tiene forma plana y consiste básicamente en un papel de celulosa de elevada pureza, la fase móvil en la Kira disuelta la muestra es un líquido apolar y está formado por solventes cuya naturaleza depende de los componentes a separar, la fase estacionaria también es de naturaleza líquida pero polar y queda retenida por entre las fibras de celulosa, la cromatografía en papel es del tipo liquido-liquido .

El resultado final es una serie de manchas consecutivas separadas entre sí algunas veces estás manchas no son visibles por lo que es necesario colorearlas.

 debemos detectar y cuantificar las sustancias separadas utilizando técnicas de elución,La elusión  consiste en la separación soporte componentes de la muestra,Recortamos los trozos de papel correspondientes a cada mancha lo coloreamos si las manchas no tienen color propio y los introducimos en recipientes con un disolvente adecuado, cuando la mancha papá ya ha pasado al disolvente líquido coloreado resultante se mide por fotometría de absorción

 la cromatografía así realizada se denomina unidimensional.

 -  cromatografía en capa fina:

 el soporte utilizado también es plano y es una capa muy fina de partículas por ejemplo gel de sílice situado sobre una lámina de vidrio plástico aluminio, la fase móvil es un líquido adecuado a las sustancias a separar, mientras que la fase estacionaria está representada por partículas depositadas sobre el soporte ( cromatografía líquido/ sólido)

el mecanismo de separación es del tipo de la absorción. Atención puede hacerse utilizando luz uV o colorantes la cuantificación se basa en métodos de elución o métodos fotodensitometricos Que requieren un aparato llamado fotodensitometro.

- cromatografía en columna:

 utilizando una fase móvil líquida o gaseosa, la fase estacionaria puede ser líquida o sólida en ambos casos.

 nos da las siguientes posibilidades de cromatografía en columna:

- fase móvil líquida:

+ fase estacionaria sólida- líquido/sólido por absorción

+ fase estacionaria líquida- líquido/ líquido  por partición

- fase móvil gaseosa:

+ fase estacionaria sólida- gas/ solido por absorción

+ fase estacionaria líquida- gas/ líquido por partición

 las columnas con las que se trabajan estás cromatografías están formadas por un tubo de longitud y ancho variable que llevan empaquetados en su interior un soporte sólido dicho soporte puede comportarse directamente como fase estacionaria( sólida) o estar empapado en un líquido que es el que se comporta como la fase estacionaria( líquido)

 dos técnicas cromatograficas en columna:

 cromatografía líquida de alta resolución( HP LC)

 cromatografía de gases

 cromatografía líquida de alta resolución o HP LC

 es básicamente una cromatografía líquido líquido de partición o reparto realizada en columna y dotada de un sistema impulsor de la fase móvil.

 la fase móvil es impulsada con una determinada presión esto acelera el proceso de separación reducíéndolo a minutos.  los distintos componentes separados de la muestra son detectados por diversos sistemas, fotometría de absorción, pluviometría, espectrometría de masas y representados en un gráfico denominado cromatograma.

 cromatografía de gases:

 es una cromatografía gas líquido repartición o reparto realizado en la columna cuya fase móvil es un gas inerte procedente de una botella presión sobre el que se inyecta la muestra está debe ser volátil y cuya fase estacionaria está representada por un líquido no volátil que empapa al soporte sólido contenido en la columna, incluye un sistema calefactor que tiene como fin volatilizar la muestra cuando pasa por el. La detección de las sustancias separadas de la muestra puede hacerse por técnicas de conductividad térmica, ionización de llama, captura electrónica. Como en el