Espectrofotometría y Calibración en Análisis Químico

La ley de lamber y la ley de beer

La ley de lamber tiene que ver con el largo del medio absorbente, esta ya no corre porque el largo de la cubeta se estandarizó. Y la ley de beer tiene que ver con la concentración del medio absorbente en donde está el compuesto que absorber. La absorbancia y transmitida son lo mismo solo que se ven de puntos de visat distintos. La transmitancia es lo que se a transmitido que es la luz incidente partido por la luz que paso por diez por q esta por %. Solo se utiliza para medir materiales aislantes.

Absorbancia y Absortividad

Absorbancia es la cantidad de radiación de un haz que a sido atenuado al pasar por un medio absorbente en función del largo y la concentración del medio absorbente.

A= a*l*c o A= e *l*c

La aplicación es para la cuantificación de elementos en una solución

Absortividad: Constante de proporcionalidad con la que el compuesto absorbe luz a una determinada longitud de onda, e función de las característica propias de compuesto

Esta ley es útil pero hay un punto en el cual ya no están utilil, la ley de beer se basa en que la absorbancia aumenta proporcionalmente a medida que la concentración del compuesto aumenta o disminuye pero este razonamiento funciona hasta cierto rango cuando el elemento esta demasiado concentrado ya no se vuelve lineal no es proporcional se pierde. Porque lo ideal es que el compuesto este suficientemente separado entre sí por solvente para q los rayos de luz pasen sin que se molesten entre si las moléculas o que el soluto interactúa demasiado con el solvente.

Siempre con longitud de onda máxima.

Desviación química

Cuando un analito se disocia, asocia o reacciona con el solvente, etc

Radiación parásita

Luz externa, que proviene desde fuera del haz principal, se infiltra y pasa por el monocromador, y es inespecífica, y atraviesa la muestra hasta los detectores. Disminuirá la linealidad

Celdas de muestra desajustadas

Componentes de los Espectrofotómetros (UV-VIS). Espectrofotómetro = Espectrómetro + Fotómetro La parte Espectrómetro: produce, dispersa y detecta o mide la luz. La parte Fotómetro: mide la intensidad de esa luz para cuantificarla.

Calibración e Importancia

La calibración sirve para cuantificar un método un análisis, pero el método se lleva a cabo bajo ciertas circunstancias

Pasos a seguir para cuantificar un analito.

1. Selección del método.
2. Toma de la muestra.
3. Preparación de la muestra. Se usan protocolos específicos para el tipo de muestra.
4. Dilución de la muestra
5. Cambio de forma química.
6. Eliminación de interferencias.
7. Medición
8. Calculo de resultados hay factores previos antes de realizar el análisis Selección de longitud de onda.

La calibración es un conjunto de operaciones que busca una relación entre la medición o señal que da el equipo, instrumento o método con un valor que es el que entrega el estándar que se considera como verdadero y real.Patrones o estándares • Patrones básicos: son los más perfectos, como por ejemplo: kilogramo, mol, metro, Kelvin, etc. •Estándar químico: vínculo entre los patrones básicos y los analíticos, per ejemplo número de Avogadro, pesos atómicos, constante de Planck, etc.• Estándares analíticos: son el resultado entre los dos anteriores son sustancias homogéneas que permiten relacionar una concentración de algo que nos interese analizar con la señal que da el equipo Ej: material de referencia y material de referencia certificado (calibrador de glucosa, proteína total, colesterol, etc.Calibración de instrumentos y métodos Calibración de Instrumentos uno está comprobando el correcto funcionamiento del instrumento Objetivo: corregir la respuesta instrumental de un equipo. Misma magnitud medida que la del patrón. El patrón no contiene el analito.Cuando uno calibra un método está caracterizando la respuesta, esta relacionando la respuesta la señal del instrumento en función de la especie química que uno quiere analizar. Objetivo: establecer la relación entre la señal y una propiedad del analito. La magnitud medida es distinta que la magnitud conocida del patrón. El patrón contiene el analito. Calibración instrumental (de equipos). Es la comparación de los valores obtenidos por un instrumento de medición contra los valores dados por un patrón de medida.Tipos más comunes de calibración instrumental. 1.- Calibración por comparación directa: Se compara directamente los valores dados por el instrumento, con los valores proporcionados por el patrón o calibrador. Ej: pHchímetro, balanza analítica, termómetro, multímetro digital (tester), espectrofotómetroTipos de calibración de métodos instrumentalesCalibración con estándar externo (simple o directa): se basa en hacer la curva de calibración a diferentes concentraciones Se usa un estándar que contenga el analito. Se prepara fuera de la muestra problema, y se analiza antes y por separado de la muestra problema con el analito. Consiste en hacer diluciones seriadas del analito (estándar) de concentraciones conocidas, a las cuales se le mide la señal. Así se relaciona la concentración de la dilución, con una señal que entregue el equipo. Ventajas: Rápido, simple, barato, práctico. Bien realizado es de mucha confianza. Desventajas: Asume que la respuesta del instrumento será la misma cuando mide al estándar y a la muestra. Esto puede dar incertidumbre por: posibles contaminaciones, incorrecta elaboración de blancos y patrones. Por eso hay que asegurarse de realizar todo lo mejor posible.Importancia de calibrar instrumentos y métodos. • Ajustar y comprobar las mediciones de los instrumentos, y relacionar correctamente las concentraciones de los estándares con las mediciones de los instrumentos, para asegurar que los resultados de análisis sean lo más cercano posible a lo verdadero. • Producir información analítica fidedigna que permita resolver problemas, en la sociedad, industria u otro cliente en particular. • Es necesario calibrar instrumentos y métodos cada cierto tiempo. • Para probar la calidad del resultado de un instrumento o de un método se realiza control de calidad, que es justamente realizar mediciones de comprobación del estado de calibraciones, para detectar posibles errores o desviaciones en los resultados que entreguen tanto los instrumentos como los métodos.SEÑAL Y RUIDOseñal: Corresponde a la información relativa al analito. La información que nos interesa. Ruido: Corresponde a información no deseada que degrada la exactitud y precisión de la información relativa al analito. Es una señal imprecisa y aleatoria. Aumenta el límite inferior de la cantidad del analito detectable. Ruido instrumental: desviaciones aleatorias observadas cuando se repiten mediciones de señales que se controlan de forma continua.S/R Es la proporción entre la potencia de la señal que se transmite y la potencia del ruido que la corrompe. Efecto del ruido sobre la señal: En un equipo, normalmente el ruido es: Constante. Independiente de la señal. E imposible de evitar por completo. Normalmente es muy muy pequeña. *El efecto del ruido sobre la señal aumenta a medida que la cantidad que se mida disminuye. La relación S/R cuantifica la calidad de un instrumento para realizar análisis determinados.Relación Señal/Ruido. 1.- Ruido químico. Surge de variables incontrolables que afectan a las características químicas que se analizan. Temperatura. Afecta a los equilibrios químicos y a las densidades de las muestras y reactivos. Además de las velocidades de reacción. Presión. Afecta a los equilibrios químicos Humedad. Puede producir cambios en el contenido de humedad de las muestras y reactivos. Vibraciones. Que ocasionan estratificación de las muestras. Cambios en intensidad de luz. Compuestos muy fotosensibles. Vapores de laboratorio. Que interactúan con los reactivos y muestras 2.- Ruido instrumental. Se relaciona con cada componente del instrumento. Es complejo e inevitable. Ruido térmico de Johnson: Fluctuaciones de voltaje. Ruido de Disparo: fotones pasando por uniones entre componentes del instrumento. Ruido fluctuante: depende de la frecuencia, de la longitud de onda, es muy inconsistente y poco estudiable, pero existe. Ruido ambiental: radiación electromagnética cercana, electrostática, etc.

ESPECTROFOTOMETRÍA Y SU APLICACIÓN

La conjugación entre 2 o más cromóforos tiende a desplazar la l de máxima absorción aún más hacia la región UV-VIS (200 - 700nm), más hacia el rojo. Auxocromos. Grupos funcionales que sustituyen al cromóforo y alteran l de máxima absorción y/o también e (Absortividad Molar). Cromóforos. Son grupos funcionales de una especie química, que tienen electrones de enlaces capaces de sufrir transiciones electrónicas que absorben radiación a diferentes l, pero dentro del espectro UV-VIS. Espectro de absorción: Representación grafica de la energía (en forma de radiación electromagnética) absorbida por la especie química, en función de la longitud de onda Las posiciones de los máximos de absorción se afectan por la naturaleza del solvente

Análisis cuantitativo mediante medición de absorción.Se aplica en todos los campos en donde se requiere información química cuantitativa, debido a: 1.- Gran aplicabilidad tanto para sistemas orgánicos como inorgánicos 2.- Limites de detección de 10-4 a 10-5 M. 3.- Selectividad de moderada a alta. 4.- Buena exactitud: incertidumbre de 1 – 3%. Incluso menos. 5.- Fácil obtención de datos.Aplicaciones en especies absorbentes. • Se les llama absorbentes porque son especies químicas que ya absorben suficiente radiación dentro de un rango medible por un espectrofotómetro UV-VIS. (absortividad molar e relativamente alta). • Sin necesidad de una reacción de transformación químicEj: Para-nitrofenol (4-nitrofenol).Análisis cuantitativo mediante medición de absorción.

Aplicaciones en especies NO absorbentes. • Las especies NO absorbentes, de por sí no absorben radiación dentro del rango UV-VIS.

• Por eso requieren de una transformación química, una reacción entre un reactivo y la especie química NO absorbente, que genere productos con gran capacidad de absorción (alto e) en las regiones UV-VIS.

• Estos productos normalmente tienen una Absortividad molar (e) de varios ordenes de magnitud superior a la de la especie NO absorbente.

• Necesitan que la reacción sea completa o al menos representativa, para que el compuesto resultante represente proporcionalmente a la especie NO absorbente.

• Sirve para moléculas y para iones metálicos.

Consideraciones previas a un análisis (continuación). *El primer paso es establecer condiciones de trabajo que originen una relación lineal entre la absorbancia y la concentración del analito (especie química).

Selección de longitud de onda.

• Barrido espectral: Se recomienda usar la l con mayor Absortividad Molar (e), es decir, la l del Peak.

• En esa l la relación absorbancia y concentración es más lineal y confiable.

• Así se cumple mejor la Ley de Lambert-Beer.

• Las pequeñas incertidumbres y el ruido son mucho menos influyentes en el resultado cuando la l es la máxima.

Consideraciones previas a un análisis (continuación).

Variables que influyen en la absorbancia.

• Naturaleza del solvente. Normalmente siempre será un buffer disuelto en agua, a un pH conveniente.

• pH. Idealmente el pH está ajustado para obtener la mezcla de especies iónicas que da la l con más e.

• Temperatura. A mayor temperatura la solución es menos densa, por tanto la absorbancia se mostrará falsamente disminuida. A menor temperatura pasa lo contrario. En el caso de las enzimas es más notorio, a menor T° el DAbs/min esmenor, y a mayor T° el DAbs/min es mayor.

• Alta concentración del analito: En ocasiones hay que diluir la muestra, para no sobrepasar la linealidad

Consideraciones previas a un análisis (continuación).

Limpieza y manipulación de celdas (cubetas). • Siempre limpias, no ralladas, no desgastadas. • Bien cuidadas. • Seguir protocolos de limpieza estrictamente.

Determinación de la relación entre absorbancia y concentración. • El método de calibración simple o con patrones externos es el más usado, por su practicidad y baratez. • Preparar curva de calibración y obtener ecuación de la recta. • Ideal que el estándar tenga composición parecida a la de la muestra. Ej: si la muestra es de suero (amarillo) de sangre, que el estándar sea un suero sintético (amarillo) de sangre. Y que no sea transparente sin color

La ecuación nos ayudara a interpolar o extrapolar la concentración de alguna muestra de concentración desconocida, pero del mismo analito, no de otro, usando solo la absorbancia de ésta, habiéndola hecho pasar por la transformación química respectiva.

TIPOS DE REACCIONES QUÍMICAS MEDIDAS POR ESPECTROFOTOMETRÍA

Fenómeno de Aparición y Desaparición de producto.

A una l determinada, se puede observar la aparición o desaparición de un cromóforo.

El ejemplo más conocido es el NADH:

A 339 nm tiene un l máx y otro a 259nm.

Y sirve para evaluar reacciones enzimáticas que tiene acopladas reacciones auxiliares de oxido/reducción de NADH/NAD+.

Reacciones de punto final

Son transformaciones químicas de especies NO absorbentes en donde la reacción llega a un punto en el que se acaba.

Por tanto se detiene la formación de cromóforo.

La cantidad de cromóforo formado es proporcional a la cantidad de analito NO absorbente que había en la muestra.

También, Puede ser una reacción de precipitación, que forma una turbidez.

Hay distintas variantes, pero el principio es el mismo, de punto final.

Siempre miden cantidades por volumen, como: mg/dL o g/dL. Y en algunos casos porcentajes %, si se relacionan correctamente.

Tipos de reacciones actuales usadas en química clínica. Cinéticas.

Son un tipo de transformación química, en donde se mide indirectamente la cantidad de enzima en la muestra, por medio de la aparición o desaparición de un cromóforo que representa la actividad enzimática de la enzima en la muestra.

Tipos de reacciones.

Reacciones de 2 puntos. O cinéticas a 2 puntos.

cinéticas a 2 puntos.

Estas reacciones se comportan como una cinética, donde la velocidad de formación del cromóforo es proporcional a la cantidad de analito en la muestra.

Ejemplos. Creatinina Urea. Sodio fotométrico Potasio fotométrico

Este tipo de reacciones miden cantidades por volumen, como: mg/dL o  g/dL.

Idealmente se usan para analizar analitos que en su solución también hay sustancias inespecíficas que reaccionan con el reactivo de detección, más lentamente.

Así se valora principalmente el analito de interés, y se elimina mayoritariamente las inecpecificidades

Análisis de conceptos.

Limite de detección: Concentración mínima de analito que puede detectarse para un nivel de confianza aceptable, es decir que puede ser distinguida del ruido.

Limite de cuantificación. Concentración mínima de analito que puede cuantificarse para un nivel de confianza aceptable.

Sensibilidad Capacidad de un método o instrumento de diferenciar pequeñas diferencias en la concentración de los analitos. Depende de la pendiente de la curva de calibración.  Si hay 2 métodos que miden el mismo analito, el que tenga mayor pendiente será el más sensible.

Linealidad/rango válido de medición/rango dinámico.

Intervalo de concentración en la que es aplicable el método. Linealidad: capacidad del método de producir resultados directamente proporcionales a la concentración del analito en la muestra. Robustez: capacidad del método para no ser afectado por pequeños cambios deliberados en sus parámetros y provee una indicación de su confiabilidad durante su uso normal.

Selectividad: Grado de ausencia de interferencia debidas a otras sustancias contenidas en la matriz de la muestra.