Un ejemplo de ficha técnica de peluquería

La cromatografía engloba un conjunto de métodos analíticos, utilizados para la separación de los componentes de una muestra, mediante su diferente distribución entre una fase fija y otra móvil.//La fase móvil o eluyente es un disolvente que engloba los componentes de la muestra (analitos) que se pretenden separar y los arrastra a lo largo de la fase fija.//La fase fija o estacionaria es un producto que ejerce una retención en grado distinto sobre cada uno de los componentes de la muestra.//En la cromatografía, los diferentes componentes de la muestra son vehiculizados y arrastrados por el eluyente a lo largo de la fase estacionaria, que, al interactuar con cada uno de ellos, retiene más a unos que a otros, por lo que, cada uno de los componentes progresa a lo largo de la fase estacionaria con una velocidad distinta producíéndose una separación de los mismos.//Se conoce como poder de resolución de la técnica cromatográfica a la capacidad que tiene ésta para separar los diversos componentes de la muestra sometida a estudio.//Podemos decir entonces que la cromatografía es un método de separación; sin embargo, mediante la incorporación a los aparatos que sirven para hacer algunos tipos de cromatografías (cromatógrafos), de detectores e integradores, se puede mejorar la identificación de las sustancias separadas e, incluso, es posible su cuantificación. //TIPOS DE CROMATOGRAFÍA: Según la naturaleza de las fases: Si la fase móvil es un líquido, la cromatografía es líquida. Si la fase fija es un sólido, la cromatografía es de tipo líquido-sólido (LSC), y, si la fase fija es un líquido extendido sobre la superficie de un soporte sólido, la cromatografía es de tipo líquido-líquido (LLC)//Sin embargo, si la fase móvil es un gas, la cromatografía es de gases; si la fase fija es un sólido, la cromatografía es de tipo gas-sólido (GSC); y si la fase fija es un líquido extendido sobre la superficie de un soporte sólido, la cromatografía es de tipo gas-líquido (GLC).//Según la forma en que está dispuesta la fase fija: La cromatografía es plana si la fase fija es un papel de filtro o un sólido extendido, a modo de fina capa, sobre la superficie de un soporte en forma de lámina. En este último caso, la cromatografía es en capa fina. Sin embargo, si la fase fija está situada en el interior de un soporte en forma de columna, la cromatografía es en columna.//Según el mecanismo de actuación de la fase fija: CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN : Se basa en la interacción entre los analitos y un adsorbente, que es usado como fase fija. El adsorbente es un sólido poroso que posee unos grupos activos capaces de atraer a los analitos y retenerlos en su superficie, mediante fuerzas electrostáticas, puentes de hidrógeno, etc. Como los grupos funcionales de cada analito son distintos, el sólido adsorbente interacciona con una desigual intensidad y, por lo tanto, ejerce una retención de grado distinto sobre cada uno de ellos. El adsorbente más frecuentemente utilizado es el gel de sílice (sílica-gel). La cromatografía de adsorción puede ser líquido-sólido o gas-sólido. Puede realizarse en columna o en capa fina.//CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN: Se basa en la separación de los analitos a consecuencia de su diferente distribución entre dos fases inmiscibles. La fase fija consiste en un líquido que se extiende uniformemente sobre la superficie de un soporte sólido constituido por partículas inertes (por ejemplo, partículas de sílice). La fase estacionaria puede estar unida al soporte de una forma mecánica o química. Además, el eluyente es otro fluido que difiere notablemente de la fase fija en su polaridad.//Así pues, si se utiliza como fase fija un líquido polar (como el etilénglicol) y la fase móvil es un líquido no polar (como el hexano), los analitos más polares son retenidos con mayor fuerza en el interior de la fase estacionaria y los analitos menos polares son retenidos por ésta con menos fuerza, debido a lo cual estos últimos progresan con mayor rapidez y, por lo tanto, “eluyen” antes. A este tipo de cromatografía de partición se le conoce como cromatografía de fase normal.//Por el contrario, si la fase fija es un líquido no polar (como el decano) y el eluyente es un líquido polar (como el agua), cuanto mayor es la polaridad de los analitos, más alta es su tendencia a permanecer en la fase móvil y, por lo tanto, más rápidamente eluyen. A este tipo de cromatografía de partición se le denomina cromatografía de fase inversa o reversa.//La cromatografía de partición suele ser de tipo líquido-líquido, pero también puede ser de tipo gas-líquido. Puede realizarse en capa fina o una columna.///CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO: Este tipo de cromatografía se basa en la afinidad de iones en disolución por iones de carga eléctrica contraria (contraiones), que están presentes en la fase estacionaria. En ella, por lo tanto, la principal fuerza de interacción entre los analitos y la fase fija es la electrostática, es decir, la atracción de cargas opuestas.//En esta cromatografía, la fase estacionaria consiste en unos grupos iónicos covalentemente unidos a un soporte sólido poroso que, generalmente, es una resina. Además, el eluyente suele ser una solución acuosa tamponada, que contiene un ion cuya carga eléctrica es igual a la del analito y opuesta a la de los grupos iónicos situados en la superficie de la resina. En ella se produce una competición entre el analito y los iones de la fase móvil por su uníón a los sitios iónicos de la fase fija.//Así pues, por ejemplo, si los grupos funcionales de la fase estacionaria son positivos (grupos catiónicos) y el contraión del eluyente es negativo, mientras que los analitos de carga eléctrica más negativa interaccionan fuertemente con la fase fija y, por lo tanto, son muy retenidos por ella y tardan en eluir, los analitos de carga eléctrica menos negativa interaccionan débilmente con la fase estacionaria y, por consiguiente, son poco retenidos por ella y eluyen con rapidez. A este tipo de técnica se le conoce corno cromatografía de intercambio aniónico. La cromatografía de intercambio aniónico retiene aniones.//Por el contrario, si los grupos funcionales de la fase estacionaria son negativos (grupos aniónicos) y el contraión del eluyente es positivo; los analitos menos positivos eluyen rápidamente y los más positivos lo hacen con dificultad. Esta cromatografía es de intercambio catiónico. La cromatografía de intercambio catiónico retiene cationes.//Los analitos retenidos por la fase fija pueden ser forzados a soltarse de ella y eluir, mediante un tampón muy rico en contraiones que compiten con el analito y lo desplazan de su uníón a la fase estacionaria, o mediante un tampón ajustado a un pH apropiado para invertir la carga eléctrica del analito y, por lo tanto, para hacer que éste se suelte de la fase fija y eluya. La cromatografía de intercambio catiónico retiene.//Las cromatografías de intercambio iónico son sólido-líquidas y normalmente se realizan en columna.///CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR: La cromatografía de exclusión molecular, de filtración por gel o de penetrabilidad se basa en la difusión selectiva de las moléculas de los analitos, vehiculizadas por la fase móvil, a través de los poros de la fase fija, debido al diferente tamaño molecular de cada una de ellas.//En este tipo de cromatografía, la fase móvil puede ser un solvente acuoso u orgánico, dependiendo de que el analito sea soluble, respectivamente, en uno u otro tipo de disolvente. Además, la fase estacionaria siempre es químicamente inerte; pero, si el eluyente es un solvente acuoso, la fase fija es un gel hidrófilo en forma de perlas porosas, que, al sumergirse en el solvente, se hincha. Si la fase móvil es un solvente orgánico, la fase estacionaria es un gel hidrófobo que sólo se hincha al sumergirse en este último tipo de solvente orgánico. En esta técnica, el grado de retención de los analitos depende del tamaño relativo de las moléculas de éstos con respecto al tamaño de los poros de la fase fija.//El gel está formado por partículas porosas que dejan espacios entre ellas. Así pues, mientras que las moléculas pequeñas penetran profundamente a través de los poros de las partículas del gel y, por consiguiente, se incluyen en lafase estacionaria y son retenidas por ésta, las moléculas grandes no penetran por los poros de la fase fija y se escapan entre los huecos que dejan entre si los granos de gel. De este modo, las moléculas grandes, al ser arrastradas con facilidad por la fase móvil que fluye, progresan rápidamente a través de la fase estacionaria y salen de ella las primeras, las moléculas intermedias eluyen más tardíamente y las moléculas pequeñas, al ser retenidas por la fase fija, se retardan con respecto a las anteriores y eluyen al final de la prueba. Las cromatografías de exclusión molecular son líquido-sólido y normalmente se realizan en columna.//CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD: Se utiliza para separar sustancias utilizando interacciones biológicas muy específicas, como las de enzima-sustrato, antígeno-anticuerpo y hormona-receptor. La técnica requiere que el compuesto que quiera separarse se una reversiblemente a un ligando específico que se ancla a una matriz insoluble. El compuesto que se quiere separar se une al ligando y el resto de las sustancias se eliminan mediante lavado.//Para eluir la sustancia se cambia el pH, o se añade otro ligando por el que la fase estacionaria tenga mayor afinidad.//Las cromatografías de afinidad son líquido-sólido y se realizan en columna.//Cromatografía en capa fina: La cromatografía en capa fina se desarrolla sobre un soporte plano. Los mecanismos de separación más comunes son la adsorción, cuando la fase estacionaria es sólida, y la partición, cuando la fase estacionaria es una fina película líquida que recubre el soporte plano. La fase fija suele ser un adsorbente situado sobre la superficie de un soporte sólido a modo de fina capa de unos 0,25 cm de espesor. Los adsorbentes más utilizados son la alúmina, y el sílicagel (puede llevar incorporado un indicador de fluorescencia), y, como soporte sólido, suelen emplearse láminas de aluminio, de vidrio o de plástico.//Si la muestra que contiene los analitos sometidos a estudio, es un líquido complejo (por ejemplo, orina o suero) debe realizarse una extracción de los mismos previamente a la prueba. A la hora de realizar la prueba, se aplica este extracto sobre la capa fina, de una forma concentrada en un punto y a 1,5 cm del borde inferior de ésta. Seguidamente, se sitúa la capa fina en posición vertical y en el interior de una cubeta especial, en cuya base se ha vertido con anterioridad el volumen de eluyente necesario para alcanzar una altura de 0,5 a 1 cm. Tras esto, el eluyente asciende por capilaridad a lo largo de la capa fina y arrastra simultáneamente los analitos con una diferente intensidad, dependiendo de la naturaleza de cada uno de ellos. Finalmente, cuando la fase móvil alcanza una determinada altura (preferiblemente 10 cm), medida desde el punto de aplicación del extracto, se retira la capa fina y se deja secar.//Los analitos separados se aprecian como manchas redondeadas (spots) si son analitos coloreados, si no lo son, pueden observarse mediante un visor de fluorescencia o/y mediante la aplicación de reveladores, es decir, de productos químicos capaces de producir un color cuando entran en contacto con las sustancias investigadas. Los hay generales, como el iodo o específicos para cada tipo de sustancia investigada.//Para aclarar la naturaleza de las sustancias (identificación) se procede de la las siguientes formas: Cálculo del factor de retención (Rf). El Rf de un analito es el cociente entre la distancia recorrida por el analito (detectado en forma de mancha) y la recorrida por el eluyente. Cada analito separado tiene su propio Rf y éste es un valor carácterístico que le diferencia del resto//Sembrado de patrones al mismo tiempo que las muestras.//Para cuantificar cada uno de los analitos se puede aplicar patrones a distintas concentraciones y comparar el área de la mancha con la del analito de las siguientes maneras: Midiendo su diámetro, Raspando las manchas y pesando, Raspando la mancha y valorando por espectrofotomatria, Midiendo la disperción de radiación mediante reflectometría utilizando un reflectómetro.// La cromatografía en capa fina se emplea para separar e identificar multitud de analitos como drogas, aa. 

Cromatografía en columna abierta: En este tipo de cromatografía, la fase fija se sitúa en el interior de un tubo de vidrio o de plástico que tiene una espita de salida en su extremo inferior. El tamaño de la columna puede ser mayor o menor. En este último caso, se dice que es una micro columna. Los mecanismos más frecuentes son el intercambio iónico, la exclusión molecular y la afinidad.//Además, la fase móvil es un líquido que es capaz de disolver la muestra, pero que no reacciona con los analitos que ésta contiene y, sin embargo, sí puede desplazarlos de su uníón a la fase fija. Se emplean con todos los mecanismos que hemos estudiado.//A la hora de realizar esta prueba, en primer lugar, se deposita la muestra en el extremo superior de la columna para que se deslice a lo largo de ella y los analitos que se pretende separar se fijen a la fase estacionaria con diferente intensidad, según la estructura química de cada uno de ellos. Seguidamente, se añade un cierto volumen de eluyente en el interior de la columna. Con ello se liberan, de su uníón a la fase fija, los analitos que se fijan a ella con menos fuerza, por lo que éstos quedan libres y salen al exterior con la fase móvil (son eluidos).//Finalmente, se puede forzar la salida de los analitos que se unen a la fase fija con una mayor intensidad, mediante el vertido en el interior de la columna de otro eluyente con una mayor capacidad de desplazamiento de los analitos que el primero.//Si se agregan, sucesivamente, varios eluyentes que tienen una capacidad de desplazamiento de los analitos progresivamente mayor, se puede obtener una serie de fracciones líquidas que contienen los analitos adecuadamente separados. En este caso, se puede acoplar un colector automático de fracciones a la salida de la columna. Este proceso sirve a modo de identificación.//Para cuantificar cada una de las fracciones se determina por espectrofotometría VV-UV.//En el laboratorio de análisis clínicos, esta técnica suele emplearse para obtener y cuantificar posteriormente la hemoglobina glicosilada y la hemoglobina A2. Como técnica de separación se utiliza en la purificación de ácidos nucleicos.//Cromatografía sobre columna automatizada. En este tipo de técnicas el eluyente, junto con los analitos entran a presión a través de la columna, disminuyendo el tiempo de análisis. A la salida de la columna existe un detector que detecta cada componente eluído, por ejemplo mediante una técnica espectroscópica. La respuesta gráfica adopta la forma de un pico mas o menos Gaussiano y se denomina CROMATOGRAMA. La separación es tanto mas eficaz cuanto mas resueltos aparezcan los picos. Se ha de distinguir el inicio, el fin y el máximo.//IDENTIFICACIÓN. Cada pico tiene su tiempo de retención. El tiempo de retención es el tiempo que tarda un analito en emerger de la columna, es el tiempo que tarda en detectarse el analito y ser registrado, en forma de pico, contado desde el momento en el que se inyecta la muestra. El tiempo de retención es el dato que contribuye a la identificación del analito, comparado con el obtenido con un patrón que incluye a ese analito. //CUANTIFICACIÓN. Se calcula el área de cada pico. El área será directamente proporcional a la concentración del analito. Por lo tanto se calcula la concentración del analito en la muestra, comparando el área del pico que le corresponde, con el logrado al inyectar un patrón constituido por una disolución del analito, a una concentración conocida. Puede hacerse a un solo punto o mediante curva de calibrado, como ya sabemos.//Cromatografía LÍQUIDA DE ALTA EFICACIA (HPLC). La cromatografía líquida de alta eficacia es un tipo especial de cromatografía en columna en la que la fase móvil es impulsada a lo largo de la columna a una presión muy alta. Permite la separación de los analitos, además de su identificación y cuantificación. Cuando la muestra es un líquido complejo, las impurezas que contiene provocan una disminución de la eficacia de la separación cromatográfica. Para evitarlo se utilizan métodos de clean-up de la muestra: la filtración, la centrifugación, la precipitación, la extracción con disolventes, la purificación con cromatografías preparatorias… Partes de un cromatógrafo líquido: Depósitos con eluyente. En la HPLC, la fase móvil suele ser una mezcla, en proporciones variables, de dos componentes. Los reactivos utilizados han de tener un grado de pureza especialmente alto. Además el eluyente debe ser filtrado y desgasificado.//Bomba. Es el componente que establece un flujo de eluyente a la presión necesaria desde el frasco en que está éste hasta la columna. Es necesaria debido a que la fase fija, presente en la columna, opone una gran resistencia a ser atravesada por la fase móvil, por lo que ésta debe ser impulsada a una presión muy alta. Proporcionar un caudal constante de eluyente a la columna ajustado en ml/min. Algunas proporcionan una fase móvil de composición constante (isocrática); Otras pueden proporcionar una fase móvil cuya composición varía durante la corrida cromatográfica (con gradiente de elución).//Inyector. Permite la introducción de la muestra en la «cabeza» de la columna. Hay inyectores automáticos que inyectan gran número de muestras y hacen más fáciles los análisis de rutina.//Columna. Es un cilindro de acero inoxidable. Hay dos tipos de relleno: pelicular y de partícula porosa (en desuso). El primero consiste en bolas de vidrio cubiertas de una capa de fase estacionaria (sílica gel y tendríamos una cromatografía de absorción, resina de intercambio iónico, etc). En el caso de las de absorción presentan en su superficie presenta una red de grupos activos (siloxano y silanoles), que interaccionan con los analitos. A su vez si se trata de una cromatografía líquido-líquido o de reparto, las bolas de vidrio están recubiertas por una fase estacionaria líquida, o tener una capa orgánica externa. Esto sucede, por ejemplo, cuando se liga químicamente, a través de los grupos silanoles, un polímero de octadecilsilano a la superficie de la sílice. Los grupos están en posición perpendicular a la superficie generando una estructura de cepillo. Esto será la fase estacionaria líquida y orgánica (FASE REVERSA).//Detector. Es el componente que detecta la presencia de analitos en el eluyente a la salida de la columna. Genera una señal eléctrica que es proporcional a la concentración de cada analito. Los más habituales son: Detectores de absorbancia ultravioleta visible (espectrofotómetros UV-VIS). En la actualidad el diode array permite medir la absorbancia, simultáneamente, a multitud de longitudes de onda. Esto facilita mucho la identificación de los analitos, mediante el estudio de los espectros obtenidos con cada uno de ellos.//Espectrómetros de masas. Dan información sobre la estructura molecular de los analitos.//Integrador-registrador. Obtiene el cromatograma//La HPLC se emplea en múltiples procesos analíticos, como, por ejemplo, en clínica los aminoácidos, la hemoglobina glicosilada, las catecolaminas. También es útil estudios toxicológicos.///Cromatografía DE GASES. La cromatografía de gases es útil para la separación de analitos gaseosos o compuestos volátiles que no pierdan sus carácterísticas físico-químicas al entrar en estado gaseoso. Partes de un cromatógrafo de gases: Bombona con gas eluyente. En la cromatografía de gases, la fase móvil es un gas inerte (gas portador), como el He o el N2 que fluye, de una forma constante y regulable.//Inyector. La muestra con el analito se introduce, mediante una jeringa especial y a través de una membrana plástica, en un recinto de inyección, recalentado eléctricamente a unos 350 °C, que es atravesado por el eluyente gaseoso. Al hacer esto, inmediatamente se volatiliza la solución que contiene el analito y éste se incorpora al fluyo de fase móvil que se dirige hacia la columna.//Columna. Las columnas de cromatografía de gases son tubos capilares, de 0,1 a 0,2 mm de diámetro y de varios metros de longitud, en cuyo interior se dispone la fase fija. El tubo capilar que forma parte de la columna puede estar constituido por diferentes materiales, como acero inoxidable, aluminio, vidrio e, incluso, plástico. La columna esta introducida en un horno que evita que los analitos volátiles pasen a estado líquido. A la derecha vienen caracterizadas los tres tipos básicos de columnas.//Detector. En cromatografía de gases se emplean numerosos tipos de detectores, dependiendo de la naturaleza de las sustancias que se desea analizar. Así pues, entre los detectores más frecuentemente utilizados en esta técnica cabe distinguir el espectrómetro de masas.///ELECTROFORESIS CAPILAR. Es una técnica analítica que sirve para separar las moléculas en relación con su carga eléctrica neta. Se conoce como carga eléctrica neta de una molécula a la suma de las cargas positivas y negativas de sus grupos ionizables. En el curso pasado pudiste estudiar la electroforesis de zona. Debajo tenemos un esquema recordatorio para el caso concreto de la electroforesis en acetato de celulosa.//La solución tampón crea el pH adecuado a la separación y además contribuye a mantenerlo garantizando que todas las moléculas conserven una carga eléctrica constante, durante toda la separación. En este caso, todas las proteínas plasmáticas adquieren carga negativa. Se define el punto isoeléctrico (pI) como aquel valor de pH al cual el balance de cargas positivas y negativas superficiales de una sustancia es cero (carga neta nula). Al pH de su punto isoeléctrico, una sustancia no presenta carga neta alguna y por lo tanto, al ser sometida a un proceso electroforético no migra, permanece inmóvil en el punto de aplicación.. Cuando el pH del medio es inferior a su pI, la sustancia se encuentra cargada positivamente y se dirigirá al polo negativo (cátodo). Cuando el pH es superior al pI, la sustancia se encuentra cargada negativamente y migrará al polo positivo (ánodo). Pero hay una fuerza que se opone a la movilidad electroforética, y es el flujo electrosmótico. El flujo electrosmótico o electroendósmosis es una corriente de cationes hidratados hacia el cátodo contraria al flujo de la migración de los componentes de la muestra que se dirigen ánodo (aniones). Se produce por la adhesión de las CATIONES DEL TAMPÓN a radicales OH- y COO-, que se encuentran en la superficie del soporte, y que al aplicar el potencial forman una corriente situada sobre estos radicales. Esta “contracorriente”, arrastra a todas las moléculas presentes, independientemente de su carga, incluídos. Los analitos. El flujo electroosmótico puede influir, considerablemente, en la movilidad electroforética. Sin embargo, este defecto de la electroforesis tradicional, es la clave de la ELECTROFORESIS CAPILAR.//Para ello se utiliza, en vez de una lámina de acetatocelulosa o un gel como soporte, un capilar hueco de silica gel, material conocido en cromatografía por su gran capacidad de adsorción, y tender a estar cargado negativamente. Los extremos del capilar se encuentran situados en el cátodo y el ánodo, y está relleno de tampón. Presenta la ventaja de que se pueden utilizar altos voltajes, y por lo tanto hacer separaciones rápidas ya que el calor generado se disipa fácilmente debido a la elevada relación entre la superficie externa y el volumen interno del capilar.//Para el caso que nos ocupa las muestras se sitúan en el cátodo, y es el efecto electrosmótico el que las desplaza al ánodo, retrasando a los componentes de la muestra con carga negativa (que van al cátodo) y favoreciendo a los de carga positiva que suman al efecto electrosmótico, su propia movilidad electroforética. De esta manera se produce la separación. De poder trabajar con campos eléctricos altos sin el problema añadido de la temperatura, dio lugar a la electroforesis capilar//Es de fácil automatización y pueden utilizarse detectores de todo tipo, fluorimétricos, espectrofotométricos, etc, que realizan la medida directamente, a través de la pared del capilar.