Efecto de la concentración de albumina sobre la actividad enzimática de la pepsina
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90.101. Introducción a la Espectrofotometría
La espectrofotometría es un método instrumental analítico que permite cuantificar y caracterizar un compuesto en solución.
Se fundamenta en las propiedades de los átomos y moléculas de absorber y emitir energía dentro del espectro electromagnético, específicamente en los rangos de luz Ultravioleta (UV), luz Visible y luz Infrarroja.
Se fundamenta en las propiedades de los átomos y moléculas de absorber y emitir energía dentro del espectro electromagnético, específicamente en los rangos de luz Ultravioleta (UV), luz Visible y luz Infrarroja.
Por ejemplo, la luz visible tiene la capacidad de excitar la retina y producir el fenómeno conocido como la visión (colores). El espectro electromagnético debe visualizarse en términos de unidades de energía y, por lo tanto ésta se propaga en forma de onda. La distancia que se produce entre 2 máximos o mínimos de esta onda propagada se denomina longitud de onda (
l) y determina el contenido energético de la luz propagada..
l) y determina el contenido energético de la luz propagada..
Regíón Espectro electromagnético | Longitud de onda |
Luz UV | 200 a 400 nm |
Luz Visible | 400 a 700 nm |
Luz IR | 700 a 30000 nm |
La interacción entre la materia y la radiación electromagnética se verifica en una variedad de fenómenos: Reflexión, Refracción, Absorción, Interferencia, Difracción, Polarización e Ionización.
Los métodos espectrrofotométricos de análisis se basan en el fenómeno de absorción.
PRINCIPIOS Y LEYES DE LA FOTOMETRÍA
Cuando la luz atraviesa un medio transparente, parte de ella puede ser absorbida por algún componente del medio, de modo que la intensidad de la luz trasmitida, It (luz que atraviesa o sale del medio) es siempre menor que la intensidad de la luz incidente, Io (luz que llega al medio).
Lambert (1760), trabajando con placas de vidrio, encontró que a medida que el espesor del medio transparente ( l)
Aumentaba en progresión aritmética (1, 2, 3, 4...), la intensidad de la luz transmitida disminuía en progresión geométrica (16, 8, 4, 2...); es decir, la intensidad de la luz transmitida (It) era igual al producto entre Io (intensidad de la luz incidente) y la potencia en base 10 con el exponente negativo (- e l ), donde e es una constante propia del medio transparente (coeficiente de extinción) y l el espesor del medio:
Aumentaba en progresión aritmética (1, 2, 3, 4...), la intensidad de la luz transmitida disminuía en progresión geométrica (16, 8, 4, 2...); es decir, la intensidad de la luz transmitida (It) era igual al producto entre Io (intensidad de la luz incidente) y la potencia en base 10 con el exponente negativo (- e l ), donde e es una constante propia del medio transparente (coeficiente de extinción) y l el espesor del medio:
It = Io x 10 -e l
Beer (1852) aplicó estos mismos principios al estudio de la absorción de la luz con soluciones coloreadas, de diferentes concentraciones y encontró la misma relación, de modo que a medida que la concentración de la solución aumentaba en progresión aritmética, la intensidad de la luz transmitida (It) disminuía en progresión geométrica :
It = Io x 10 -e C
Combinando ambas ecuaciones se obtiene la Ley de Lambert-Beer, que relaciona la disminución de la intensidad de la luz transmitida con la concentración y el espesor o largo de una solución, lo que puede expresarse matemáticamente como:
It = Io x 10 -e l c
En sentido estricto, esta ley se cumple rigurosamente cuando se utiliza una radiación monocromática.
Si dividimos ambos términos de la ecuación por Io tenemos:
Si dividimos ambos términos de la ecuación por Io tenemos:
It / Io = 10 -e l c
La razón It/Io se llama transmisión o transparencia del sistema, por lo tanto, cuando la luz transmitida es igual a la luz incidente, el valor de esta razón es igual a 1,0, lo que significa que el sistema es absolutamente transparente. Si descartamos, por medio de un control adecuado, o blanco, la luz absorbida por el solvente y las paredes del continente de la solución, nos referiremos solamente a la transparencia del soluto disuelto que se desea medir. En este caso se habla de transmitancia.
Lo contrario a transmisión o transparencia se denomina opacidad y corresponde al valor recíproco de ésta, es decir, Io/It. Tomando logaritmos en ambos miembros de la ecuación (4) y reordenándola algebraicamente, se obtiene:
Log Io /It = e l c
El logaritmo de la opacidad (log Io/It) se denomina absorción o extinción.
Estos términos no son actualmente usados y se prefieren los términos de densidad óptica (DO) o absorbancia (A):
Estos términos no son actualmente usados y se prefieren los términos de densidad óptica (DO) o absorbancia (A):
DO = A = e l c
Así, la absorbancia es directamente proporcional al espesor (l) y a la concentración (c ) de una solución y, además, depende de una constante e (coeficiente de extinción)
Que es carácterística de cada sustancia, a una longitud de onda y solvente determinados. Por lo tanto, si mantenemos constante el espesor o largo (l) de una solución, la densidad óptica de dicha solución, a una longitud de onda dada, dependerá exclusivamente de su concentración ( c) y esto nos permite medir la concentración de las sustancias en solución.
Que es carácterística de cada sustancia, a una longitud de onda y solvente determinados. Por lo tanto, si mantenemos constante el espesor o largo (l) de una solución, la densidad óptica de dicha solución, a una longitud de onda dada, dependerá exclusivamente de su concentración ( c) y esto nos permite medir la concentración de las sustancias en solución.
El valor del coeficiente de extinción de una sustancia se puede determinar experimentalmente haciendo que el producto de la concentración de la sustancia y el espesor, o trayecto atravesado por la luz, sean iguales a 1,0 (l x c = 1). En ese caso, el valor de la absorbancia de la solución es igual al valor de e. El valor numérico de este coeficiente dependerá de las unidades que se elijan para expresar el espesor y la concentración. Se emplea generalmente el centímetro (cm) como unidad para el primer parámetro, mientras que la concentración se expresa en molar (moles por litro), aun cuando se puede emplear cualquier unidad de concentración. Si se mide o se calcula la absorción de una solución 1 M de una sustancia, colocada en una cubeta de 1 cm, se obtiene el coeficiente de extinción molar. Cuando la concentración se expresa en gramos por litro se obtiene el coeficiente de extinción específico. Los valores de estos coeficientes, son dependientes del solvente, de la longitud de onda y temperatura, y corresponden a una propiedad específica de la molécula del soluto.
90.102. Espectros de Absorción.
El color de los cuerpos o sustancias que nos rodean se debe a la recepción, en nuestras retinas, de la o las radiaciones que no han sido absorbidas por el cuerpo o sustancia, al hacerles incidir luz blanca artificial o natural (solar). Así, una solución de color rojo tiene ese color porque la sustancia en solución absorbe todas las longitudes de onda del espectro visible, excepto aquellas correspondientes al color rojo, las que son reflejadas por la solución. Por esta razón, si queremos medir la concentración de una sustancia en solución, aprovechando la relación que existe entre concentración y absorbancia (ley de Lambert-Beer), debemos elegir aquella luz (color de la luz o longitud de onda equivalente) que es absorbida con mayor intensidad por la sustancia en solución.
La curva que se obtiene al graficar absorbancia de una sustancia en solución versus longitud de onda se denominaespectro de absorción de dicho compuesto. El espectro puede presentar uno o más máximos de absorción, lo que permite identificar a qué longitud de onda el compuesto presenta máxima absorbancia. La mayoría de los compuesto presentan máximos de absorbancia en el rango de la luz visible (400-700 nm); sin embargo, es posible que aquellos compuestos incoloros posean máximos de absorbancia en el rango UV (200-400 nm), por ejemplo, la gran mayoría de las proteínas en solución son incoloras pero poseen un máximo a 280 nm, mientras que las soluciones de ácidos nucleicos absorben a 260 nm.
Habitualmente, la longitud de onda de luz que una sustancia absorbe, corresponde al color complementario al que la sustancia tiene. Si una solución tiene color rojo, el color que absorbe con mayor intensidad es el verde;
Si tiene color amarillo absorbe principalmente el color violeta;
Si tiene color azul absorbe principalmente el color naranja.
(ver diagrama). Estas relaciones son también aplicables en el sentido inverso.
Si tiene color amarillo absorbe principalmente el color violeta;
Si tiene color azul absorbe principalmente el color naranja.
(ver diagrama). Estas relaciones son también aplicables en el sentido inverso.
Rojo (620-760 nm) NaranjaVioleta (400-450 nm) (590-620 nm) AmarilloAzul (450-500 nm) (570-590 nm) Verde (500-570 nm) |
Los fotocolorímetros son instrumentos diseñados para seleccionar el color de la luz útil para la medición que se desee.
Los filtros coloreados se interponen entre la fuente luminosa y la solución que se va a medir. Estos filtros, además de su color, pueden identificarse por la longitud de onda a la cual son transparentes, que regularmente llevan grabados (Rojo 640; Naranja 600; Amarillo 590; Verde 540; Azul 470; Violeta 420). Otros modelos de fotómetros poseen un monocromador interno conectado a una perilla de comando que permite “discar” la longitud de onda que se desea obtener desde la fuente de luz del equipo.
90.103. Curvas de Calibración
Para determinar experimentalmente la concentración de una sustancia en solución, es necesario que dicha sustancia posea una longitud de onda de máxima absorbancia. Si la sustancia no es coloreada (no absorbe luz visible), es necesario aplicar un procedimiento o reacción química que genere un compuesto con un máximo de absorbancia en el rango visible, o bien utilizar otro rango del espectro electromagnético, como por ejemplo rango ultravioleta (UV) o infrarrojo.
Cuando se va a medir la concentración en un fotocolorímetro es indispensable mantener constante el espesor o largo ( l) de la solución. Para esto se usan tubos especiales con las dimensiones correspondientes para ser colocados en los portacubetas de los instrumentos, denominados cubetas o tubos de fotómetro, dependiendo de la forma. En estas condiciones, el valor de la absorbancia (A) de la solución queda determinada por el valor de dos constantes (e yl) y por la concentración ( c ) del soluto absorbente en solución. El producto de las dos constantes puede ser reemplazado o considerado como una sóla constante denominada K o factor de calibración.
Por lo tanto:
Lo cual significa que para calcular dicha concentración debemos conocer la Absorbancia de la solución y el valor del factor K (ex 1), que es una constante carácterística para cada sustancia.
A = K x c
Luego, la concentración de una solución está dada por c = A / K;Lo cual significa que para calcular dicha concentración debemos conocer la Absorbancia de la solución y el valor del factor K (ex 1), que es una constante carácterística para cada sustancia.
El valor del factor de calibración K puede calcularse empíricamente realizando una curva de calibración, la que se prepara midiendo la absorbancia de una serie de soluciones de concentraciones crecientes exactamente conocidas (soluciones patrones)
De la sustancia en estudio. Una vez obtenidos los valores de Absorbancias para las diferentes concentraciones de las soluciones patrones, se grafica A vs concentración (curva de calibración).
De la sustancia en estudio. Una vez obtenidos los valores de Absorbancias para las diferentes concentraciones de las soluciones patrones, se grafica A vs concentración (curva de calibración).
Este gráfico permite:
a) determinar los límites de concentración que obedecen la ley de Lambert-Beer (linealidad entre absorbancia y concentración),
b) obtener el valor de K mediante el cálculo de la pendiente de la recta, o,
c) alternativamente, calcular el valor de K para cada punto de la recta (K = A/c)
Y luego, obtener el valor promedio o K promedio.
Y luego, obtener el valor promedio o K promedio.
Conocido el valor del factor de calibración K para la técnica fotométrica empleada, la concentración desconocida de la sustancia tratada con el mismo procedimiento analítico, puede ser determinada después de medir la absorbancia de la solución problema, interpolando el valor de absorbancia en la gráfica o aplicando la ecuación:
90.108. Guía Efecto de Temperatura sobre la actividad enzimática
C = A / K
90.104. Guía Laboratorio de Espectro de Absorción
Un espectro de absorción de un compuesto corresponde a la curvaque se obtiene al graficar absorbancia de unasustancia en solución versus longitud de onda de dicho compuesto. El espectro puede presentaruno o más máximosy mínimos de absorción, lo que depende de los tipos de enlace y funciones químicas presentes en el compuesto. En función de lo anterior, se puede establecer que cada compuesto presenta un espectro único, lo que su estudio es un medio de identificación de compuestos. Además, permite identificar a qué longitud de onda el compuesto presenta máximos y mínimos de absorbancia, lo que determinara la y/o las longitudes de ondas que se utilizaran para realizar estudios cuantitativos del compuesto.
En el laboratorio, se realizará experimentalmente un espectro de absorción de un compuesto que absorba en el rango visible.
Cada grupo de trabajo recibirá 2 tubos de espectronic: uno con un compuesto o pigmento en solución y el otro con el solvente de la solución. Este último será utilizado como blanco en las mediciones.
a)Se determinará la absorbancia de un compuesto en estudio a diferentes longitudes de onda: 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675 y 700 nanometros (nm). A cada longitud de onda deberá calibrar el instrumento con un blanco, que corresponderá al solvente en que se encuentra el compuesto disuelto. Grafique el espectro obtenido
b)En función del espectro (curva) obtenida, el docente le indicará en que rangos de longitudes de onda, deberá repetir las mediciones – aunque esta vez-
1. Graficar en papel milimetrado, el espectro de absorción del compuesto en estudio, debe identificar las longitudes de ondas, a las cuales el compuesto presenta máximos y mínimos.
2. Indicar a que longitud de onda realizaría el análisis cuantitativo del compuesto en estudio.
3. En base al espectro obtenido por usted, identifique a que pigmento o solución coloreada corresponde de los del listado proporcionado por el docente en el laboratorio.
MÉTODO DE BIURET PARA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
Existen diversosmétodosanalíticosparadeterminar la concentración de proteínas en solución, los que se utilizan en función de:
- la concentración de proteínas de la muestra problema
- la cantidad de muestra disponible
- si se desea recuperar o no la muestra.
A continuación, se mencionan los métodos espectrofotométricos y sus carácterísticas, más comúnmente usados en BIOQUÍMICA, para la determinación de proteínas en solución:
En el laboratorio, se realizará experimentalmente un espectro de absorción de un compuesto que absorba en el rango visible.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Cada grupo de trabajo recibirá 2 tubos de espectronic: uno con un compuesto o pigmento en solución y el otro con el solvente de la solución. Este último será utilizado como blanco en las mediciones.
a)Se determinará la absorbancia de un compuesto en estudio a diferentes longitudes de onda: 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675 y 700 nanometros (nm). A cada longitud de onda deberá calibrar el instrumento con un blanco, que corresponderá al solvente en que se encuentra el compuesto disuelto. Grafique el espectro obtenido
b)En función del espectro (curva) obtenida, el docente le indicará en que rangos de longitudes de onda, deberá repetir las mediciones – aunque esta vez-
Cada 5 nm
Grafique el nuevo espectro obtenido.Expresión DE RESULTADOS
1. Graficar en papel milimetrado, el espectro de absorción del compuesto en estudio, debe identificar las longitudes de ondas, a las cuales el compuesto presenta máximos y mínimos.
2. Indicar a que longitud de onda realizaría el análisis cuantitativo del compuesto en estudio.
3. En base al espectro obtenido por usted, identifique a que pigmento o solución coloreada corresponde de los del listado proporcionado por el docente en el laboratorio.
90.105. Guía Laboratorio Curva de Calibración
MÉTODO DE BIURET PARA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
Existen diversosmétodosanalíticosparadeterminar la concentración de proteínas en solución, los que se utilizan en función de:
- la concentración de proteínas de la muestra problema
- la cantidad de muestra disponible
- si se desea recuperar o no la muestra.
A continuación, se mencionan los métodos espectrofotométricos y sus carácterísticas, más comúnmente usados en BIOQUÍMICA, para la determinación de proteínas en solución:
Método | Rango | L ( nm ) | Carácter destructivo |
Absorción Ultravioleta | 0,1 -0,6 mg/mL | 280 | no |
Bradford | 0 - 50 ug/mL | 595 | si |
Lowry | 5 - 100 ug/mL | 720 | si |
Turbidimétrico | 0,1 -3 mg/mL | 540 | si |
Biuret | 0,5 -10 mg/mL | 540 | si |
Método DE BIURET
En soluciones alcalinas fuertes, el compuesto llamado biuret (NH2-CO-NH-CO-NH2) reacciona con el sulfato de cobre (CuSO4)dando un compuesto de “color violeta”. Esta reacción, llamada reacción de Biuret es muy general, ya que la dan positiva todoslos compuestos que se asemejan estructuralmente al compuesto biuret, particularmente las proteínas que, a través de susenlaces peptídicos, forman un complejo organometálico entre el ión cúprico y el grupo NH del enlace peptídico.
Los dipéptidos y los aminoácidos (con excepción de histidina, serina y treonina) no forman complejos coloreados. Los iónes amonio y la urea interfieren en la reacción dando “falsos positivos”.
En las muestras biológicas, con las excepciones mencionadas, no hay otras sustancias, que den positiva la reacción de Biuret, de modo que este método se puede utilizar para la determinación cuantitativa de proteínas en solución, entre los límites de concentración de 50 mg % a 1.000 mg %, en la solución problema.
REACTIVOS
·Reactivo de Biuret
·Solución estándar de proteínas al 1 % p/v.
PROCEDIMIENTO
Para determinar concentración de proteínas por el método de Biuret, se debe preparar una curva de calibración del método, por medio de una batería de tubos que incluyen el blanco fotométrico y los tubos de diferentes concentraciones crecientes de patrones exactamente conocidos.
Tubos Nº
Soluciones | Bco. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
Estándar Caseína 1% p/v | -- | 0.20 | 0.40 | 0.60 | 0.80 | 1.00 |
H2O | 1.00 | 0.80 | 0.60 | 0.40 | 0.20 | -- |
Reactivo Biuret | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 | 4.00 |
Mezclar e incubar 10 minutos a 37º C. Leer la absorbancia a 540 nm.
Expresión DE RESULTADOS
1.Tabular resultados: tubo, absorbancia, mg proteínas totales en tubo
2.Graficar la curva de calibración (A540 vs mg proteína/ tubo).
3.Determinar el factor de calibración en gráfico y calculado en base a la ecuación de
Lambert-Beer (matemático
IMPORTANTE: Todo valor debe indicar sus unidades dimensionales
90.106. Guía Laboratorio, Curva de calibración para determinación de Glicógeno, Método iodo/ioduro
CURVA DE CALIBRACIÓN MÉTODO DEL IODO / IODURO,
PARA DETERMINACIÓN DE GLICOGENO
Este método se basa en la formación de un complejo coloreado entre el polisacárido (glicógeno o almidón) con yodo. Las moléculas de iodo se incorporan en el interior de las regiones helicoidales del polisacárido originando un complejo de color café-amarillo con el glicógeno o azul con almidón.
La adición de sales neutras (por ejemplo, solución de NaCl saturada) estabiliza e intensifica el color del complejo formado. Es un procedimiento rápido y específico que permite medir pequeñas cantidades de glicógeno y almidón. El color desarrollado depende directamente de la concentración del polisacárido y, en cierto modo, del largo de las cadenas exteriores.
El método permite determinar la concentración de glicógeno entre los límites de 50-250 mg de glicógeno por ml de la solución problema y la concentración de almidón entre los límites de 0-750 mg de almidón por ml de muestra problema.
REACTIVOS
-Solución yodo-yodurada.
-Solución saturada de cloruro de sodio.
-Reactivo de yodo (130 ml de solución saturada NaCl + 0.5 ml solución I2-I-)
-Solución patrón de glicógeno 25 mg %
PROTOCOLO CURVA DE CALIBRACIÓN PARA GLICÓGENO:
SOLUCIONES | Ml en el tubo NºBlanco 1 2 3 4 5 MP | |||||
Estándar Glicógeno 25 mg % | 0,2 | 0,5 | 0,7 | 1,0 | ||
Muestra problema | -- | -- | -- | -- | -- | 1,0 |
Solución ácido tricloracético (TCA) al 5 % | 1,0 | 0,8 | 0,5 | 0,3 | -- | -- |
Reactivo I2/I- | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
MP: MUESTRA PROBLEMA
AGITAR PARA MEZCLAR Y LEER DE INMEDIATO LA ABSORBANCIA A 460 NM
Resultados:
1.Construya la curva de calibración en papel milimetrado
2.Calcule el factor de calibración obtenido por el método gráfico
3.Calcule la concentración de la muestra problema
Este control contiene todos los componentes del ensayo enzimático, excepto que el volumen de sustrato es reemplazado por un volumen equivalente de amortiguador o agua. Este control permite cuantificar, al término del ensayo, la cantidad de producto que originalmente estaba presente en la preparación enzimática usada y/o el producto formado a partir de sustrato presente originalmente en la preparación enzimática (contaminación endógena).
Este control contiene todos los componentes del ensayo enzimático, excepto que el volumen de enzima es reemplazado por un volumen equivalente de amortiguador o agua. Este control permite cuantificar, al término del ensayo, la cantidad de producto formado no-enzimáticamente (en ausencia de la enzima), a consecuencia de la inestabilidad química del sustrato.
Este control contiene todos los componentes del ensayo enzimático, necesarios para la determinación de la actividad de la enzima pero, la reacción enzimática se detiene en el momento mismo de completar la adición de los componentes del ensayo, agregando el agente inactivador inmediatamente después de completar la adición del último componente de la mezcla de reacción. Este control permite cuantificar la cantidad de producto presente al inicio del ensayo y, en consecuencia, acusar interferencias debidas a cualquiera de los componentes de la mezcla de reacción, que debe ser tomada en cuenta en la cuantificación de la actividad enzimática.
90.107 Guía Enzimología Experimental
UNIDAD DE ENZIMOLOGÍA
INTRODUCCIÓN
La velocidad de la reacción enzimática, se determina en función de la cantidad de desaparición de sustrato o de la cantidad de producto formado por unidad de tiempo.
La velocidad de una reacción enzimática depende de la cantidad de enzima activa presente en la reacción.
Cuando la concentración de sustrato es saturante, la totalidad de la enzima se encuentra formando el complejo enzima-sustrato y la velocidad de la reacción es máxima y directamente proporcional a la concentración total de enzima presente en el medio.
Para determinar las velocidades de las reacciones catalizadas por las enzimas, es necesario conocer el o los sustratos y el o los productos de dichas reacciones y disponer de los métodos analíticos para su cuantificación; por lo tanto, es necesario comprobar que el método fotométrico utilizado para medir la concentración de sustrato (o producto) de la reacción enzimática, obedece la ley de Lambert-Beer a la concentración del sustrato o del producto analizado. Para esto, es necesario disponer de una curva de calibración para el método de medición.
Es necesario disponer de una curva de progreso que permita establecer el tiempo de incubación en el que la formación de producto es proporcional al tiempo de incubación y la concentración de enzima que genere la cantidad de producto que esté dentro de los límites de detección del método fotométrico seleccionado.
Con el propósito de descartar resultados que son consecuencia de artefactos experimentales que puedan simular una actividad enzimática y alterar las determinaciones cuantitativas de concentraciones de productos o sustratos, se deben usar controles. Los más importantes en enzimología son los siguientes:
BLANCO SUSTRATO
Este control contiene todos los componentes del ensayo enzimático, excepto que el volumen de sustrato es reemplazado por un volumen equivalente de amortiguador o agua. Este control permite cuantificar, al término del ensayo, la cantidad de producto que originalmente estaba presente en la preparación enzimática usada y/o el producto formado a partir de sustrato presente originalmente en la preparación enzimática (contaminación endógena).
BLANCO ENZIMA
Este control contiene todos los componentes del ensayo enzimático, excepto que el volumen de enzima es reemplazado por un volumen equivalente de amortiguador o agua. Este control permite cuantificar, al término del ensayo, la cantidad de producto formado no-enzimáticamente (en ausencia de la enzima), a consecuencia de la inestabilidad química del sustrato.
TIEMPO CERO
Este control contiene todos los componentes del ensayo enzimático, necesarios para la determinación de la actividad de la enzima pero, la reacción enzimática se detiene en el momento mismo de completar la adición de los componentes del ensayo, agregando el agente inactivador inmediatamente después de completar la adición del último componente de la mezcla de reacción. Este control permite cuantificar la cantidad de producto presente al inicio del ensayo y, en consecuencia, acusar interferencias debidas a cualquiera de los componentes de la mezcla de reacción, que debe ser tomada en cuenta en la cuantificación de la actividad enzimática.
A una concentración constante de enzima, el efecto del aumento de la concentración de sustrato sobre la velocidad enzimática, está establecida por la ecuación de Michaelis-Menten, cuya representación gráfica corresponde a una hipérbola rectangular asintótica. Para ensayar o evaluar una enzima, lo habitual es elegir una concentración tal de sustrato que permita que la reacción sea deorden cero (esto es, una velocidad que es independiente de la concentración de sustrato usado). Esto se consigue realizando el ensayo a una concentración 10 o 100 veces mayor que el valor de la KM de la enzima, es decir, una concentración saturante de sustrato. El estudio del efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de la enzima permite determinar el valor de las dos constantes cinéticas de la enzima, su KM y su VMAX.
La velocidad de una reacción enzimática es influenciada por múltiples factores que deben tenerse presente para la correcta medición de la velocidad enzimática, por lo tanto, en el laboratorio se analizará el efecto de algunas variables que influyen en la actividad de las enzimas: pH, temperatura, concentración de sustrato y presencia de inhibidores:
El pH de los ensayos enzimáticos debe mantenerse constante durante la incubación (lo que se logra utilizando un amortiguador o tampón apropiado) ya que la velocidad de una reacción enzimática está influenciada por el pH del medio de incubación. Los residuos de aminoácídos que participan en la catálisis presentan diferentes grados de ionización a diferentes valores de pH del medio de incubación, por lo que la mayor velocidad alcanzada por la enzima será cuando esta se incube en su pH óptimo.
La temperatura modifica la velocidad de la reacción enzimática, por lo que debe mantenerse constante durante el curso de la reacción, lo que se consigue fácilmente al realizar el ensayo en baños termoregulados. A medida que la temperatura de incubación aumenta, la actividad de la enzima aumenta, hasta alcanzar la denominada temperatura óptima experimental. A temperaturas superiores, el proceso de desnaturalización se hace cada vez más evidente, hasta producirse una total inactivación de la enzima. No existen reglas definidas para elegir la temperatura a la cual se realizará la determinación de la actividad de la enzima, ya que el tiempo de incubación es una variable que influye en dicha elección; lo habitual es que sea entre 20º y 45º C. La temperatura influye, además, sobre la estabilidad de la enzima, que en general es más alta mientras más baja sea la temperatura.
Finalmente, si se grafica la cantidad de producto formado en una reacción enzimática en función del tiempo, se obtendrá la denominada “curva de progreso” de la reacción. A cortos tiempos de incubación y a concentraciones de sustrato saturantes, la relación producto versus tiempo es directamente proporcional. A medida que el sustrato se consume en el tiempo, la curva tiende a aplanarse, debido entre otras situaciones a mencionar: (i) la reacción ha alcanzado el equilibrio, (ii) la enzima tiende a denaturarse en el tiempo, y/o (iii) la concentración de producto alcanzó un nivel inhibitorio para la enzima.
UNIDADES DE Expresión DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
UNIDAD ENZIMÁTICA | ACTIVIDAD ENZIMÁTICA | ACTIVIDAD ESPECÍFICA |
U = micromoles producto minuto | U/ml de enzima=micromoles producto min x ml | U/mg proteínas=micromoles producto min x mg |
Velocidad de la reacción:
cantidad de producto formado , o bien
cantidad de producto formado , o bien
Unidad de tiempo
Velocidad de la reacción:
cantidad de sustrato desaparecido
cantidad de sustrato desaparecido
Unidad de tiempo
90.108. Guía Efecto de Temperatura sobre la actividad enzimática
EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DE UNA ENZIMA
Existen una variedad de factores físicos y químicos que afectan la actividad de una enzima, entre los que se considera la temperatura. Las enzimas como toda proteína en solución es susceptible al efecto denaturante de producido por incremento de temperatura, dado que desestabiliza y produce la ruptura de los puentes de hidrógeno, elemento estabilizador de la estructura secundaria
La actividad experimental consistirá en incubar la reacción enzimática a diferentes temperaturas (0ºC, ambiente, 30ºC, 45ºC, 55ºC y 70ºC), con el fin de determinar la temperatura optima operacional, es decir a que temperatura en las condiciones experimentales, la enzima presenta su máxima actividad catalítica. El estudio, se realizará en la enzima del tipo hidrolasa, fosfatasa ácida obtenida de germen de trigo, utilizándose el sustrato artificial p-nitrofenilfosfato.
La enzima fosfatasa ácida cataliza la reacción:
p-nitrofenilfosfato à p-nitrofenol + fosfato inorgánico
La reacción se detendrá con la adición de 1 ml de NaOH 0,4 M y la actividad de la enzima se determinará espectrofotométricamente cuantificando el producto p-nitrofenol producido a una longitud de onda de 410 nm
PROTOCOLO PARA MEDIR LA ACTIVIDAD DE FOSFATASA ÁCIDA
Reactivo | BC | 01 | 1 | 02 | 2 | 03 | 3 | 04 | 4 | 05 | 5 | 06 | 6 |
Temp. Incubación | 0°C | T° Amb | 30° C | 45° C | 55° C | 70° C | |||||||
PNFF, 3 mM | -- | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
Citrato sodio, 50 mM pH 4.8 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
H2O | 3,0 | 2,0 | 1,0 | 2,0 | 1,0 | 2,0 | 1,0 | 2,0 | 1,0 | 2,0 | 1,0 | 2,0 | 1,0 |
Fosfatasa ácida (1/250) | -- | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | ||||||
Incubar la reacción enzimática por 10 minutos a la temperatura establecida | |||||||||||||
NaOH 0,4 M | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
Mezclar en el vortex y leer absorbancia a 410 nm
ACTIVIDAD A REALIZAR POR LOS ESTUDIANTES
1.Se formaran grupos de 2 estudiantes.
2.Cada grupo preparará el protocolo experimental diseñado
3.La reacción enzimática se realizará en las condiciones estipulados en el protocolo base.
4.Al detener la reacción enzimática, mezclar en vortex y leer lectura en el espectrofotómetro a la longitud de onda indicado
5.Procesamiento de datos.
a.Construir una tabla con las siguientes columnas: absorbancia, absorbancia corregida (EN – BE), micromoles producto generado, velocidad de reacción (v= micromoles producto/minuto).
b.Factor de calibración del p-nitrofenol = 3,9 (micromol / tubo)-1
90.109 Guía Efecto del pH sobre la actividad de la enzima
Fosfatasa Acida
Objetivo
Determinar el pH al cual la enzima fosfatasa ácida presenta su máxima actividad
Procedimiento
El ensayo enzimático se incubará a 5 valores de pH distintos, utilizando amortiguadores de citrato para el rango de pH 3 – 6 y amortiguador TRIS para rangos de pH 7 -9. Para cada situación de pH se prepararan 2 tubos: un blanco enzima y ensayo completo. Una vez que todos los tubos (blancos y ensayos completos) contengan la mezcla de amortiguador, sustrato y agua correspondientes, serán pre-incubados por 2 minutos a 45ºC, de igual modo –con el mismo fin- colocara en el baño termoregulado el tubo que contiene la enzima sola por el mismo tiempo.
Transcurrido el tiempo de pre-incubación, procederá a adicionar la alícuota de enzima de acuerdo al protocolo a los tubos que corresponda iniciando la reacción.
La reacción se realizará a 45ºC. Durante 10 minutos y se detendrá adicionando NaOH 0,4 M.
Protocolo Experimental
B. Col.* | pH 3.0 | pH 4.0 | pH 4.8 | pH 5.8 | pH 6.8 | pH 8.0 | |||||||
BE | E | BE | E | BE | E | BE | E | BE | E | BE | E | ||
Citrato pH 3.0 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
Citrato pH 4.0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
Citrato pH 4.8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
Citrato pH 5.8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
Citrato pH 6.8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 | 0 | |
TRIS pH 8.0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | |
Agua destilada | 4 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 |
p-NFP | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
PRE – INCUBAR 2 MINUTOS A 45º C | |||||||||||||
Enzima | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 1 |
INCUBAR 10 MINUTOS A 45º C | |||||||||||||
NaOH 0,4 M | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
LEER ABSORBANCIA A 410 nm | |||||||||||||
*IMPORTANTE: EL BLANCO Colorimétrico NO SE INCUBA
Factor de calibración: 3,9 (micro moles p-nitrofenol/tubo)-1
Expresión de resultados
1.Hacer tabla con los resultados obtenidos
2.Determinar el pH óptimo de la enzima
3.Determinar el rango de pHs a los que la actividad de la enzima alcanza un 90%, 80% y 70% de actividad.
90.110. Guía Efecto de sustrato sobre actividad de la enzima fosfatasa ácida
Protocolo para la curva “velocidad v/s concentración de sustrato” de enzima Fosfatasa ácida:
Reactivo | BC* | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
p-NFF en el tubo (mM) | ----- | ||||||||||
p-NFF _______ (mM) | ----- | 0,20 | 0,25 | 0,30 | 0,35 | 0,40 | 0,45 | 0,50 | 0,70 | 1,0 | 2,0 |
Agua dest. | 2,0 | 1,80 | 1,75 | 1,70 | 1,65 | 1,60 | 1,55 | 1,50 | 1,30 | 1,0 | ----- |
T. Citrato pH 4,8 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
Preincubar 2 minutos a 45 ºC, todos los tubos más la enzima entubo aparte, luego.. | |||||||||||
Enzima | ----- | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
Incubar todos los tubos a 45 ºC por 10 minutos, luego agregar.... | |||||||||||
NaOH 0,4 M | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
Nota: Para cada tubo (1 al 10) prepare su correspondiente tubo Blanco de enzima (se debe incubar).
Mezclar y leer la absorbancia a 410 nm.
Obtener la absorbancia corregida (la diferencia entre la absorbancia obtenida para cada tubo y la de su correspondiente blanco enzima)
Corresponde al blanco colorimétrico y, por lo tanto, no necesita ser incubado. Prepárelo durante el período de incubación. La adición de NaOH 0,4 M debe realizarse conjuntamente con los demás tubos. Úselo para calibrar el fotómetro a 100 %T.
Expresión de resultados
1.Preparar una Tabla de Resultados
2.Graficar: i) velocidad de reacción versus concentración milimolar de p-Nitrofenil fosfato;
ii) 1/v versus 1/ [S] y los correspondientes inversos.
3.Calcular el valor de KM y Vmax, indicando las unidades correspondientes, a partir de cada gráfico.
90.111
Guía Efecto de temperatura sobre la actividad de la enzima Invertasa
90.112
Guía Efecto de concentración de sustrato sobre la actividad de la enzima Invertasa
90.111
Guía Efecto de temperatura sobre la actividad de la enzima Invertasa
OBJETIVO
Evaluar el efecto de la temperatura de incubación sobre la actividad catalítica de la enzima invertasa ydeterminar la temperatura óptima para las condiciones experimentales usadas en el ensayo experimental.
Introducción
Toda reacción química catalizada por una enzima presenta un valor de velocidad que es dependiente de latemperatura y del tiempo de incubación, entre otros factores. A bajas temperaturas, la enzima no presenta la conformación funcional apropiada por lo que la velocidad de la reacción es baja o nula. A medida que latemperatura de incubación aumenta, la velocidad de la reacción catalizada por la enzima aumenta. Sinembargo, al sobrepasar una determinada temperatura, la velocidad de la reacción tenderá a disminuir a consecuencia del proceso de denaturación que experimenta la enzima, dada su naturaleza protéica.
Por esto, al graficar velocidad versus temperatura de incubación, se obtienen curvas de tipo campana en lasque el valor de máxima velocidad se logra en una temperatura o rango de temperatura que se denominatemperatura óptima.
La temperatura óptima no es una propiedad propia de la enzima. Es un parámetrooperacional, es decir, una enzima puede presentar diferentes valores de temperatura óptima en función del tiempo de incubación; por ejemplo, si se incuba durante 3 minutos, la tº óptima podría ser de 50º C, perosi se incuba durante 15 minutos, la tº óptima para la misma enzima podría ser de 35º C.
La temperatura óptima no es una propiedad propia de la enzima. Es un parámetrooperacional, es decir, una enzima puede presentar diferentes valores de temperatura óptima en función del tiempo de incubación; por ejemplo, si se incuba durante 3 minutos, la tº óptima podría ser de 50º C, perosi se incuba durante 15 minutos, la tº óptima para la misma enzima podría ser de 35º C.
PROTOCOLO EXPERIMENTAL
Reactivos(ml) | Bco color | 01 | 1 | 02 | 2 | 03 | 3 | 04 | 4 | 05 | 5 | 06 | 6 |
Acetato 50 mM,pH 4,7 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
Sacarosa 0,3 M | 0.0 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
aguadestilada | 1.5 | 1.2 | 0.7 | 1.2 | 0.7 | 1.2 | 0.7 | 1.2 | 0.7 | 1.2 | 0.7 | 1.2 | 0.7 |
Una vez que tenga todos los tubos preparados con los reactivos arriba indicados, proceda a colocarlos a las temperaturas a las que va realizar el ensayo, de igual modo que la enzima a utilizar por 2 minutos (PREINCUBACIÓN). Luego adicione la enzima, para iniciar la reacción enzimática en cada ensayo e Incube por 10 minutos
enzima | 0.0 | 0.0 | 0.5 | 0.0 | 0.5 | 0.0 | 0.5 | 0.0 | 0.5 | 0.0 | 0.5 | 0.0 | 0.5 |
Temperatura °C | 0 | 0 | 20 | 20 | 30 | 30 | 45 | 45 | 60 | 60 | 75 | 75 |
la reacción se detiene adicionando 1 ml de 3,5-dinitrosalicilato
3,5-dinitrosalicilato | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 1 |
Incubar durante 5 minutos a 100 °C
Enfriar antes de agregar los 3 ml de agua destilada
Agua destilada | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 3 |
HOMOGENEIZAR EN VORTEX Y LEER ABSORBANCIA A 500 nm
EXPRESIÓN DE RESULTADOS
- Tabular los resultados consignando: tubo, absorbancia, absorbancia corregida, micromoles de azucares reductores, velocidad de reacción, actividad enzimática.
- Graficar velocidad (micromoles de azucares reductores / min de incubación) versus temperatura de incubación.
- Determinar la temperatura óptima operacional de la enzima
- Todo valor debe indicar sus unidades dimensionales.
90.112
Guía Efecto de concentración de sustrato sobre la actividad de la enzima Invertasa
EFECTO DE LA Concentración DE SUSTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD DE INVERTASA
OBJETIVO:
Estudiar el efecto de la concentración de sacarosa sobre la velocidad de hidrólisis catalizada por la enzima invertasa (sacarasa).
Introducción:
De acuerdo a la ecuación de Michaelis-Menten, al graficar la velocidad de reacción versus la concentración de sustrato, se obtendrá una curva hiperbólica asintótica, en un ensayo realizado a temperatura, pH, tiempo y concentración de enzima constantes.
A partir de este tipo de gráfico, se pueden determinar los parámetros cinéticos KM y Vmax. Sin embargo, el uso del denominado gráfico o curva de los dobles recíprocos (ecuación de Lineaweaver- Burk) facilita la determinación gráfica de dichos parámetros, con mayor precisión, ya que al graficar 1/v versus 1/S, se obtiene una recta cuyo interceptos en los ejes X e Y corresponden a los valores inversos de KM (-1/KM) y Vmax (1/Vmax), respectivamente.
El valor de KM para la enzima de levadura, bajo las condiciones experimentales usadas en este laboratorio (pH 4,7 y 45ºC), es de alrededor de 100 mM para sacarosa.
PROTOCOLO EXPERIMENTAL:
La enzima sacarasa o invertasa, cataliza la hidrólisis de sacarosa, de la siguiente forma:
sacarosa + H2O « glucosa + fructosa.
Las moléculas de glucosa y fructosa son monosacáridos reductores; en cambio, sacarosa es un disacárido no-reductor. En consecuencia, para evaluar la velocidad de hidrólisis de la sacarosa se puede medir la cantidad de producto formado mediante técnicas basadas en reaciones redox, tal como la reducción del reactivo
3,5-dinitrosalicilato (3,5-DNS) (amarillo) por los monosacáridos glucosa más fructosa y su transformación en 3-amino-5-nitrosalicilato (anaranjado) (ver el Tema 2.8 anterior).
3,5-dinitrosalicilato (3,5-DNS) (amarillo) por los monosacáridos glucosa más fructosa y su transformación en 3-amino-5-nitrosalicilato (anaranjado) (ver el Tema 2.8 anterior).
ÞProcedimiento para la determinación de producto formado en el ensayo enzimático:
·detener la reacción agregando 1 ml del reactivo 3,5-DNS, una vez finalizado el tiempo de incubación,
·caliente los tubos del ensayo a 100º C durante 5 minutos,
·luego, enfríelos y agregue 3 ml de agua destilada; homogenicelos en el vortex y lea la absorbancia a 500 nm , usando el blanco colorimétrico para calibrar el fotómetro a 100% T.
PROTOCOLO PARA LA CURVA “velocidadvs concentraciondesustrato”:
Reactivo | ml en el tubo Blanco colorimétrico* enzima** | ml en el tubo Nº 1 2 3 4 5 6 | |||||||
acetato 50 mM, pH 4,7 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | |
sacarosa 0,3 M | 0,0 | 0,9 | 0,1 | 0,2 | 0,3 | 0,4 | 0,5 | 0,7 | |
agua destilada | 1,5 | 0,6 | 0,9 | 0,8 | 0,7 | 0,6 | 0,5 | 0,3 | |
Enzima de levadura | 0,0 | 0,0 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | |
INCUBAR DURANTE 10 MIN A 45º C
DETENER LA REACCIÓN CON 1 ML DE 3,5-DNS Y HOMOGENIZAR CON EL VORTEX.
3,5-dinitrosalicilato | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
INCUBAR DURANTE 5 MINUTOS A 100º C
Enfriar antes de agregar los 7 ml de agua destilada.
agua destilada | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
Mezclar y leer la absorbancia a 500 nm
Corresponde al blanco colorimétrico y, por lo tanto, no necesita ser incubado. Preparelo durante el período de incubación. La adición de 3,5-dinitrosalicilato debe realizarse conjuntamente con los demás tubos. Úselo para calibrar el fotómetro a 100 %T.
** Corresponde al tubo blanco enzima y debe ser preparado e incubado junto a los demás tubos.
Expresión DE RESULTADOS
Absorbancia corregida:
la diferencia entre la absorbancia obtenida para cada tubo y la del blanco enzima.
1.Preparar una Tabla de Resultados
2.Graficar velodcidad versus concentración milimolar de sacarosa y los correspondientes inversos.
3.Calcular el valor de KM y Vmax, indicando las unidades correspondientes.