Duplicación del adn
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Explica cada uno de los pasos implicados en el aislamiento del DNA, haciendo énfasis en las propiedades de las condiciones o las sustancias empleadas.
Detergente
Ayuda a la lisis de la membrana celular proteínas, azúcares, bicapa lipídica, al romperse la misma, se puede llegar a la membrana nuclear, y permitir la salida de los ácidos nucleicos.
Solución salina
Ayuda a que el ADN se disuelva, y las proteínas se precipitan.Agua destilada:
Se baja la concentración de sales y se precipita el ADN.Mortero
Destruimos las células para hacer más fácil la destrucción. (destrucción mecánica)Etanol
Se lo agrega al final, para la precipitación de los ácidos de nucleicos.
¿Compara el método empleado en el laboratorio con los métodos considerados por las casas comerciales?
La diferencia que presentan el método empleado de un protocolo de extracción básico de ADN y el Kit comercial es el uso de proteinasa K, que sirve para atacar las proteínas que están en las membranas, la bicapa de los fosfolípidos, y esto hace que se desarrolle aberturas que desestabiliza, dado a una degradación en su estructura molecular.
La diferencia que presentan el método empleado de un protocolo de extracción básico de ADN y el Kit comercial es el uso de proteinasa K, que sirve para atacar las proteínas que están en las membranas, la bicapa de los fosfolípidos, y esto hace que se desarrolle aberturas que desestabiliza, dado a una degradación en su estructura molecular.
Como otro punto, los pasos que constan entre un método de extracción básico y un kit comercial muestran similitud en cuanto a sus pasos y sus funciones, pero, la diferencia radica en los precios de cada uno de los protocolos, ya que un kit comercial puede costar entre 500 a 1000 dólares por el equipamiento de enzimas, proteinasa K y otros compuestos. Por otro lado, el método de extracción básico se puede dar un costo de 2 a 10 dólares.
¿Efectúa la comparación anterior considerando otros protocolos? Enfatiza en aquellos pasos comunes, y explica que ventaja tiene la inclusión de algunas etapas. Los pasos y ventajas comunes que presentan tanto el protocolo tradicional básico con la ayuda del cloroformo, el protocolo alternativo con la ayuda de la solución salina y el protocolo de extracción directa por medio de microesferas magnéticas, los cuales son: Purificar, ya que, si se va a obtener el ADN, se deberá eliminar los residuos como el ARN, proteínas, etc. Y Romper la membrana celular para obtener las muestras de ADN o ARN, según el método que se vaya a emplear.
1. ¿Por qué es necesario realizar la estimación de la concentración de ADN?
Es necesario para poder cuantificar los resultados de ADN para una fase analítica de purificación, en el cual se desempeña la concentración del ADN, como por ejemplo la reacción en cadena de la polimerasa, el PCR, digestión enzimática, electroforesis, en donde se debe tomar una mínima cantidad de moléculas requeridas, según la técnica que se trabaje y la unidad de estimación de la enzima. Sin mencionar, la importancia de cuantas moléculas de ADN tendrá de partida.
2. ¿Por qué solo se toma la OD a 260nm para estimar la concentración de ADN?, por qué tomamos además la OD a 280nm? Para la absorción de ácidos nucleicos es de 260 OD, para evaluar la concentración. Para evaluar proteínas, la pureza de la muestra se necesita OD 260 nm, el cual si la relación es mayor 1.6 se considera que la muestra es suficientemente pura. Y si es mayor de 2 es porque hay ADN + ARN.
4. ¿Por qué un fragmento de ADN de 10 kb no migra más rápido que un fragmento de 1 kb, cuando se someten a un campo eléctrico en geles de agarosa, si tenemos en cuenta que el número de grupos fosfato es mayor en 10kb y por tanto más carga negativa? Porque un fragmento de 1 kb es más pequeño y es posible que pueda migrar a los poros del gel de agarosa, los cuales son de menor tamaño. Sin embargo, si es un fragmento de 10 kb es más grande en comparación de un 1kb, sin mencionar, la gran cantidad de carga negativa que pose y va a ser imposible que puedan migrar porque los poros son pequeños y el tamaño de la molécula es más grande.
5. ¿Cuál es la función de los buffer o tampones de electroforesis como el TAE 1X? ¿Qué otros tampones de electroforesis se usan en el laboratorio? La función del buffer es de ayudar a que el pH del ADN esté cargado negativamente al haber una pérdida de protones.
Se utilizan “EDTA” es ácido etilendiamino tetraacético, agente quelante de cationes divalentes, en donde se evitará una posible degradación del ADN.
Otra diferencia que radica entre el Buffer TAE y el TBE o EDTA es la migración de moléculas de ADN, según la postergación en un gel de agarosa a 0.8%, mientras que el TBE es para fragmentos más pequeños de ADN y la postergación en un gel de agarosa es del 2%.
Como otro punto, la capacidad de tamponante del TBE es más estable que el TAE.