Clonación y Expresión Genética: Procedimientos y Moduladores de Hibridación
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PARTE 4: Clonación Genética
Procedimiento
- Buscar un gen de interés.
- Obtener la secuencia del gen.
- Identificar el codón de inicio y el codón de término.
- Cortar la secuencia de nucleótidos utilizando enzimas de restricción.
- Insertar la secuencia en un vector de clonación.
- Introducir el vector en un organismo para su duplicación.
- Realizar una PCR para verificar la presencia del gen.
- Utilizar un vector de expresión para expresar el gen.
- Realizar una PCR para comprobar la expresión del gen.
- Añadir la secuencia al organismo de la hepatitis B.
- Transmitir el gen a la hepatitis B mediante microinyección o electroporación.
- Sembrar la hepatitis B en un medio axénico con un antibiótico resistente.
- Seleccionar las cepas resistentes al antibiótico.
- Realizar una PCR para verificar la presencia del gen.
- Mantener el organismo en un medio poroso.
---PARTE 2---
Diagrama de PCR
- (A) Elongación - 92°C, 5 min, 1 ciclo
- (B) Elongación final - 92°C, 5 min, 1 ciclo
- Hibridación - 65°C, 30 seg, 30 ciclos
- Polimerización - 65°C, 30 seg, 1 ciclo
- Terminación - 65°C, 30 seg, 1 ciclo
- Terminación final - (-) 1 min
Caja: Soluciones
- Solución 1: Glucosa/Tris/EDTA
- Solución 2: NaOH/SDS
- Solución 3: Acetato de potasio
3. ¿Qué es un vector de expresión?
Un vector de expresión es una construcción genética que permite la introducción de un gen exógeno determinado en una célula diana para que sea capaz de expresarlo eficientemente.
Ejemplos de vectores de expresión
- Plásmido pBR322
- pCMV-Script
- SP6
5. ¿Menciona y describe 3 moduladores de hibridación de ácidos nucleicos?
Temperatura
La temperatura elevada rompe los puentes de hidrógeno y separa las hebras del ADN (desnaturalización).
pH y productos químicos
El pH alto (pH > 11) rompe los puentes de hidrógeno, lo que produce desnaturalización. Esto también pueden producirlo agentes químicos como la urea y la formamida, e incluso el agua destilada.
Concentración de sales
La baja concentración de sales en una solución donde se produce una hibridación impone una condición de alta astringencia, permitiendo solo uniones de gran complementariedad.