Clonación molecular: vectores, transformación y selección de clones recombinantes

Resumen

El documento explica el proceso de clonación molecular, desde la elección de la célula huésped (bacterias, levaduras, vegetales o animales) y los vectores utilizados, hasta las fases de preparación del ADN, inserción en el vector y su introducción en la célula. Además, describe los métodos de transformación, transfección, transducción y electroporación, y cómo seleccionar e identificar los clones recombinantes correctos.

Puntos clave

La clonación consiste en obtener células hijas con la misma carga genética, a partir de un vector recombinante que contiene un inserto de ADN extraño.
Las bacterias son huéspedes muy utilizados por su sencillez de manipulación; los vectores habituales son plásmidos, fagos y cósmidos.
El ADN a clonar se digiere con una enzima de restricción sin diana dentro del gen de interés, y el vector se digiere con la misma enzima para generar extremos cohesivos.
La ligasa une los extremos cohesivos del inserto y del vector, pero también se generan productos no deseados como vectores recircularizados sin inserto.
E. coli no es naturalmente competente y se hace competente artificialmente con cloruro de calcio y choque térmico.
La electroporación aplica pulsos eléctricos de alto voltaje que aumentan la permeabilidad de la membrana celular.
La selección elimina las células no transformadas, mientras que la identificación reconoce las que portan el vector recombinante específico.

Ponte a prueba

Células Hospedadoras: Se introduce el vector para su amplificación y se cultiva en medios donde se multiplica.

Clon: Células hijas con la misma carga genética.

La elección de la célula depende del vector y el objetivo. Se pueden usar células bacterianas o eucariotas.

1) Bacterias: Muy utilizadas por su sencillez de manipulación y versatilidad.

Vectores: Plásmidos, fagos y cósmidos.

Cepas defectivas en: exonucleasas (para evitar la degradación del vector) y genes que controlan la recombinación (para evitar la integración del vector).

2) Eucariotas: Se utilizan de forma similar a las bacterias. Vectores: YAC y plásmidos de levadura 2 μL. Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha.

3) Vegetales o animales: Para generar organismos transgénicos.

Vectores vegetales: Plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens (bacteria del suelo que induce tumores en plantas). T-DNA: región del plásmido que se integra en el genoma vegetal.

Vectores animales: Víricos (Baculovirus en insectos o Retrovirus en mamíferos).

Fases de la Clonación

1) El vector recombinante contiene un inserto de ADN extraño.

1) Preparación del ADN a clonar: ADN bicatenario → generar extremos cohesivos.

* Partiendo de ADN genómico purificado, digerir con una enzima de restricción que no tenga diana dentro del gen de interés.

* Para un gen concreto: amplificar con PCR y luego digerir.

2) Preparación del vector de clonación: Digerir el vector con la misma enzima.

3) Inserción del ADN extraño en el vector: Mezclar en concentraciones adecuadas e incubar en condiciones óptimas. Los extremos cohesivos se unen por complementariedad con la ligasa.

Tras la unión se obtiene: Vector recombinante específico y productos no deseados como (vector recircularizado sin ADN extraño, moléculas de ADN extraño unidas entre sí, vectores unidos, otros).

2) Introducción del vector en la célula huésped.

A) Transformación Bacteriana

Captación bacteriana de ADN desnudo en el medio. Se necesitan células competentes (que permitan la entrada de material genético).

Streptococcus, Bacillus, Pseudomonas son naturalmente competentes. E. coli no lo es, pero se puede inducir artificialmente:

* Método químico: cloruro de calcio + método físico: choque térmico.

Aumenta la permeabilidad de la pared y la membrana, permitiendo la introducción del vector.

B) Transfección

Introducción del vector en células eucariotas no mediada por virus:

* Sobre cultivo en monocapa: se añade el vector recombinante con una solución tamponada de fosfato de calcio, y el vector precipita con el fosfato sobre las membranas, entrando por endocitosis.

* Incluir el vector en liposomas que liberan su contenido en el interior (más eficiente).

C) Transducción

Introducción de material genético extraño en la célula por acción de un virus. Se utilizan cultivos bacterianos con fagos recombinantes o cósmidos empaquetados en fagos.

Fagos lambda recombinantes y cósmidos se empaquetan al mezclar el vector con proteínas de la cápside vírica (partículas víricas).

Se infecta un cultivo bacteriano y se introduce el vector.

* Vector fago recombinante: ciclo lítico.

* Vector cósmido: se comporta como un plásmido.

Baculovirus, adenovirus o retrovirus: para células vegetales o animales.

D) Electroporación

Aplicar pulsos eléctricos de alto voltaje a las células huésped y los vectores. Los pulsos aumentan la permeabilidad de la membrana. Es un método eficaz.

3) Selección e Identificación de Clones Recombinantes

X Células no transformadas → no tienen ADN extraño.

✓ Células transformadas que portan el vector recombinante específico.

X Células transformadas que portan un vector no recombinante o moléculas de ADN no deseadas.

Procesos de: selección (elimina células no transformadas) e identificación (identifica las que portan el vector específico), que pueden realizarse simultáneamente o por separado.

Preguntas frecuentes

¿Qué es un vector recombinante?

Es un vector de clonación, como un plásmido, que contiene un inserto de ADN extraño. Se obtiene uniendo el ADN a clonar con el vector mediante la ligasa tras digerir ambos con la misma enzima de restricción.

¿Por qué E. coli necesita tratamiento para ser transformada?

Porque E. coli no es naturalmente competente, es decir, no capta ADN desnudo del medio. Se puede inducir artificialmente mediante un método químico con cloruro de calcio y un método físico de choque térmico.

¿Cuál es la diferencia entre transformación y transfección?

La transformación introduce el vector en células bacterianas captando ADN desnudo del medio. La transfección introduce el vector en células eucariotas sin intervención de virus, por ejemplo mediante fosfato de calcio o liposomas.