Centrifugación

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CENTRIFUGACIÓN :


1. Introducción:

El mejor método para separar un sólido insoluble de un líquido es la filtración.-.-.También se puede utilizar la técnica de decantación si el sólido se deposita fácilmente por gravedad en el fondo del recipiente (sedimentación), o si permanece en la superficie del líquido (flotación).

Un sólido sedimenta o flota dependiendo de su densidad respecto a la del líquido

-.-.-.-.En otras palabras, el sólido experimenta una fuerza ascendente debida al empuje que el líquido ejerce sobre éste, cuya magnitud es igual a la del peso del líquido desplazado por el sólido (principio de Arquímedes)
.
El sólido sedimentará si esta fuerza es inferior a la fuerza que la gravedad ejerce sobre el sólido; en caso contrario, flotará. Si las partículas son muy pequeñas, los procesos de sedimentación o flotación pueden ser extremadamente lentos debido, por un lado, a la resistencia al avance de las partículas provocada por la fricción que se establece entre éstas y las del líquido, y, por otro, a los movimientos aleatorios de las partículas inducidos por las turbulencias térmicas que se generan en el seno del líquido (difusión)
. En estos casos, hay que recurrir a la centrifugación para separarlas.

___

La centrifugación es una técnica de separación que se utiliza para aislar o concentrar partículas suspendidas en un líquido aprovechando la diferente velocidad de desplazamiento según su forma, tamaño o peso al ser sometidas a una fuerza centrífuga.

____

La fuerza centrífuga es la que se ejerce sobre un cuerpo cuando éste gira alrededor de un eje. Esta fuerza, cuya magnitud es directamente proporcional a la masa del cuerpo, el radio de giro y la velocidad de giro (o angular), es perpendicular al eje y tiende a alejar el cuerpo del mismo. La fuerza centrífuga puede acelerar el proceso de sedimentación de partículas que tienen tendencia a hacerlo espontáneamente (densidad superior a la del líquido), o provocar este proceso en aquellas que tienden a flotar (densidad inferior a la del líquido).



Fc = m · ac

...


2. Instrumental:


Tubos:

Están hechos de materiales inertes que no interaccionan con los componentes de la muestra y resistentes a la deformación a altas velocidades.-.-.-.-.La elección depende del tipo de rotor, tipo de muestra, volumen y tipo de fraccionamiento.
Pueden ser de vidrio (hasta 25.000 g) o de materiales polímericos como el polipropileno o los policarbonatos.

Centrífugas:

Hay diferentes tipos de centrífugas según el rango de velocidades de giro

:A

Centrífugas de baja velocidad, de sobremesa o clínicas

.B

Centrífugas de alta velocidad.

C

Ultracentrífugas.

A. Centrífugas de baja velocidad, de sobremesa o clínicas:

Son de pequeño tamaño y sin refrigeración. Alcanzan una velocidad máxima de 5000 rpm.
.-.-Útiles para la separación de partículas grandes como células o precipitados de sales insolubles. Incorporan una tapa de seguridad que imposibilita su apertura hasta que la centrifuga se ha detenido completamente.-.-.Las centrífugas micrófugas son una variante de las centrifugas de baja velocidad permiten llegar a velocidades de más de 10.000 rpm, siendo los volúMenes de trabajo muy pequeños.
Son útiles en el campo de la biología molecular. Otra variante son las centrifugas de hematocrito.B. Centrífugas de alta velocidad.
Alcanzan velocidades de entre 18.000 y 25.000 rpm.
Son refrigeradas y algunas tienen sistema de vacío para evitar el calentamiento del rotor a causa del rozamiento con el aire..-.Son útiles en la separación de fracciones celulares, pero insuficientes para la separación de ribosomas, virus o macromoléculas en general.

C. Ultracentrífugas:

Superan las 50.000 rpm, por lo que tienen sistemas auxiliares de refrigeración i de alto vacío. Hay ultracentrífugas analíticas que permiten la obtención de datos precisos de propiedades de sedimentación (coeficientes de sedimentación, pesos moleculares), y preparativas, útiles para aislar partículas de bajo coeficiente de sedimentación (microsomas, virus, macromoléculas).

Rotor:

Es la pieza que gira impulsada por el motor y sobre la cual se coloca la muestra.
Han de ser materiales ligeros y resistentes a altas velocidades de giro. Los mejores son de titanio y fibra de carbono ya que son ligeros y resistentes. Hay diferentes tipos de rotores:


1.
Oscilantes, flotantes o basculantes.

2.
De ángulo fijo.

3.
Verticales.

1. Oscilantes, flotantes o basculantes

El adaptador del tubo está unido al brazo del rotor por su parte superior, pero no está fijo a él. Durante la centrifugación, los tubos pierden la verticalidad a causa de la fuerza centrífuga y se sitúan perpendiculares al eje de rotación.
Se utilizan para separaciones más precisas ya que la fuerza centrífuga se ejerce en la dirección de la longitud del tubo. Se pueden separar partículas esencialmente en función de su densidad utilizando gradientes de densidad en un disolvente (isopícnicos).

2. De ángulo fijo

El adaptador del tubo tiene una cierta inclinación respecto al eje de giro.
Se utilizan para las separaciones más simples (células, orgánulos celulares, membranas, proteínas más o menos agregadas según los casos), sobre todo en separaciones secuenciales a velocidades de rotación crecientes.

3. Verticales

Rotores macizos con compartimentos esculpidos paralelos al eje.

3. Modalidades de centrifugación:


Según el propósito:


Centrifugación analítica:

Objetivo:


medir las propiedades físicas de las partículas que sedimentan, tales como coeficiente de sedimentación o su masa molecular. Especialmente la variante ultracentrifugación analítica. Las moléculas se observan mediante un sistema óptico durante la centrifugación. Los tubos de centrifuga deben ser de cuarzo para dejar pasar la luz visible y ultravioleta.
Rotor basculante observación en vertical.

Centrifugación preparativa:

Objetivo:


aislar partículas, células o moléculas para su análisis o utilización posterior.

________

Según el medio en el que se centrifuga y la forma con que se aplica la muestra. __Centrifugación diferencial.
__Centrifugación mediante un gradiente de densidades--Centrifugación zonal.--Centrifugación isopícnica o de equilibrio 3.1. Centrifugación diferencial:
Es el método más común de separación, y es rara la purificación enzimática que no lo utiliza. En este método, el tubo de centrífuga se llena con una mezcla uniforme problema. Tras la centrifugación se obtienen dos fracciones: un pellet que contiene el material sedimentado y un sobrenadante con el material no sedimentado.
El método es bastante inespecífico, y a priori no se puede saber si la partícula buscada quedará en el sobrenadante, en el pellet o repartido entre ambos.-.-.-.-.El comportamiento de cada componente de la muestra depende de su forma, tamaño , densidad y de las condiciones de centrifugación.
-.-.Es una técnica muy útil, sobre todo para aislamiento de células y orgánulos subcelulares.

3.2. Centrifugación mediante un gradiente de densidades:

Este tipo de centrifugación es un proceso mediante el cual las partículas se distribuyen en fracciones de diferentes densidades de un fluido líquido.
El método es un poco más elaborado que la centrifugación diferencial, no obstante presenta ventajas que compensan el trabajo añadido. La técnica permite la separación de varios o todos los componentes de la muestra y la realización de medidas analíticas.
El método de gradiente de densidades implica la utilización de un soporte fluido cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior.
-.-.
El gradiente se consigue con un soluto preferiblemente de baja masa molecular, de tal manera que la muestra a analizar pueda ser suspendida en la solución resultante. Como solutos se utilizan la sacarosa, polisacáridos sintéticos, derivados yodados del ácido benzoico, o sales de metales alcalinos pesados como el rubidio o el cesio, entre otros. La muestra se deposita en la parte superior del gradiente como una fina banda y, tras centrifugar, la separación de los componentes de la muestra se presenta como diferentes bandas o zonas que pueden ser separadas (o fraccionadas).-.-.Hay dos tipos de gradientes, los continuos y los discontinuos. Continuos:
los gradientes ontinuos pden ser exos a artir de gradientes discontinuos,de tal manera q los limites entre las capas comienzan a desaparecer a medida q los solutos difunden,así las discontinuidades comienzan a linealizarse y en un tiempo sufiiente la densidad se volverá comletamnte uniforme.Una forma de hacerlos es rotando cuidadosamente el tubo deuna posición vertical a 1 orizontal,bajo estas ondiiones un gradiente disontinuo se convertirá en continuo en menos de1h.



Discontinuos:


método+usado para formar gradientes discontinuos es comenzar kn la solución +densa y colocarlas en capas de menosr densidad sucesivamnte evitando efectos de mezcla y oclusión de aire.-.-.-.Hay dos variantes de este método, la centrifugación zonal y la centrifugación isopícnica:

3.2.1. Centrifugación zonal:

En la centrifugación zonal la muestra a analizar se deposita en la parte superior de un gradiente de densidades previamente formado.-.-.-.
A causa de la fuerza centrífuga las partículas se mueven a velocidades que dependen de la masa y sedimentan en diferentes zonas del gradiente.
-.-.La densidad máxima del gradiente no ha de exceder a la de las partículas a separar.

3.2.2. Centrifugación isopícnica o de equilibrio:

La centrifugación isopícnica separa les partículas en un gradiente de densidades en función de la densidad de las mismas.
Las partículas se mueven en el gradiente hasta que llegan a un punto donde la densidad de éstas i la del gradiente son idénticas (de aquí el nombre de isopícnico).-.-.En este caso, es condición fundamental que la densidad máxima del gradiente final ha de exceder siempre a la densidad de las partículas._____¨Por este motivo la sedimentación final no se produce si se controlan las condiciones de centrifugación, ya que las partículas flotan sobre un "colchón" de material que posee una densidad superior a la de éstas.
-.-.Esta técnica se utiliza, por ejemplo, para separar partículas similares en tamaño pero de diferente densidad.
En este sentido, la centrifugación isopícnica es un método adecuado para separar ácidos nucleicos o diferentes orgánulos celulares.

4. Procedimiento:

a) Colocar el tubo de muestra (suspensión o disolución) en uno de los receptáculos del rotor.

b) Compensar el tubo de muestra
colocando en el receptáculo diametralmente opuesto otro tubo con un volumen de líquido de peso idéntico al de la muestra.

C) Cerrar herméticamente el compartimento del rotor y poner en funcionamiento la centrífuga

Una vez acabada la centrifugación (normalmente las centrífugas tienen un temporizador que desconecta automáticamente el motor una vez transcurrido el tiempo programado), esperar a que se detenga el rotor para abrir la tapa del compartimento donde está alojado y sacar el tubo de muestra y el de compensación.

5. Aspectos prácticos:

La centrífuga ha de estar sobre una base sólida y fija.
-.-.El rotor ha de ser compatible con la centrífuga que se quiere utilizar y ha de estar perfectamente fijado al motor.-.-.La distribución de los tubos en el rotor ha de ser tal que éste esté perfectamente equilibrado (compensado) para evitar vibraciones durante el giro y, por lo tanto, su rotura. Si es necesario, se utilizan tubos adicionales con volúMenes de líquido de pesos idénticos a los de las muestras.-.-.
Los tubos han de ser compatibles con la centrífuga para evitar roturas durante el funcionamiento de la misma.-.-.-.La tapa que aísla el rotor del exterior ha de estar bien cerrada y asegurada.-.-.-Nunca se ha de dejar la centrífuga sin atención hasta llegar a la velocidad máxima de giro. 6.Cálculos:Conversión de la velocidad de giro (revoluciones por minuto, rpm)
a aceleración centrífuga (fuerza centrifuga relativa, FCR):-.-.-.Se conseguirá una misma separación en dos centrífugas distintas cuando sea igual su FCR, no si es igual la velocidad de giro. La relación entre ambas depende del radio del rotor.
(Medido desde el eje de giro hasta la posición de la muestra).-.-.-La FCR, se mide empleando como unidad, la aceleración de la gravedad (g).
-.-.-.

FCR =

11,19 · 10-6 · V2 · r = V2 · r / 89.365 (g).

Siendo:--

V (velocidad) = rpm.--r (radio)= cm.

Ejemplo

Calcula el nº de g alcanzado por un rotor de centrifuga, de 5 cm de radio, que gira a una velocidad de 10.000 rpm.-.-..-.R: FCR = (10.000)2 · 5 / 89.365 = 5.600 g .

El nomograma
, nos permite el cálculo de la potencia (FCR, escala C) de una centrífuga, expresado en "g", conociendo el radio de giro de la misma (escala A) y las r.P.M. (escala B) que deseamos conseguir sin necesidad de utilizar la fórmula. Para ello, mediante una regla uniremos el valor de la escala A y el de la escala B, el punto de intersección en la escala C corresponderá con la FCR de la centrífuga  

OTRAS TÉCNICAS DE SEPARACIÓN:


1. FILTRACIÓN:


1.1. CONCEPTO

Es la separación de las partículas de un sólido del líquido en el que se encuentra disuelto, mediante la utilización de un cuerpo permeable y poroso (filtro) a través de cuyos poros, de tamaño variable, pasa el líquido filtrado quedando el residuo sólido retenido.

1.2 TIPOS DE FILTROS:

Se emplean junto a un embudo cónico, dónde va alojado el filtro plegado de forma especial para aumentar la superficie de contacto.-.-.-.


Papel de filtro

: se debe realizar una elección adecuada del tamaño del poro en función del tamaño de las partículas del sólido a separar.

Membranas filtrantes

__Compuestas por polvo de vidrio aglomerado montado sobre un embudo o crisol.__Presentan resistencia a la agresión química.__Permite múltiples filtraciones.

1.3 MÉTODOS DE FILTRACIÓN:


Filtración por gravedad:

Se pueden utilizar un filtro liso, si queremos recoger sólido tras filtración, o un filtro de pliegues.
Los filtros pueden confeccionarse o comprarlos ya realizados. Su colocación en el embudo debe ser lo más ajustada posible (el borde debe superar en 1 centímetro como mínimo el borde del embudo).

Técnica de recogida:

1. Dejar reposar el líquido para que sedimenten las partículas sólidas (se acelera el filtrado).

2.
El filtro no debe nunca llenarse hasta el borde.

3.
Verter el líquido a un ritmo adecuado.

4.
Evitar salpicaduras (la varilla del embudo debe tocar la pared del recipiente colector y estar por encima del nivel del filtrado).-.-.-.

Nota:

si el líquido no aparece claro indica porosidad no adecuada del filtro.-.-.-.


Filtración por succión:

Se utiliza un matraz especial llamado Kitasato. La filtración se produce por acción de una diferencia de presión debida a la aplicación de vacío al recipiente donde se recibe el filtrado.

2. Diálisis:


2.1 CONCEPTO:

Una bolsa construida con un material semipermeable (poros cuyo diámetro está comprendido entre 15 y 0,025 micras), se llena con la muestra y mediante un proceso de difusión se produce la filtración molecular, solo atraviesan la membrana los líquidos y las moléculas de menor tamaño quedando retenidas las de mayor tamaño.

2.2 UTILIDAD:

Enriquecimiento proteico en fluidos biológicos.

3.DECANTACIÓN:


TÉCNICA:

1.
Dejar reposar la mezcla para que el sólido sedimente.

2.
Extraer el sobrenadante con una pipeta Pasteur o inclinar cuidadosamente el recipiente vertiendo el sobrenadante.

4.EXTRACCIÓN


4.1 CONCEPTO:

Separación de uno o más constituyentes de una mezcla mediante un disolvente.

4.2 CONDICIONES DEL DISOLVENTE

Ser capaz de disolver completamente la sustancia a separar (poder separador) sin disolver el resto.

4.3 UTILIDAD:

Eliminar impurezas de una muestra.- Obtener el enriquecimiento de compuestos químicos.

4.4 CLASIFICACIÓN:


Extracción sólido-líquido:

Separación de uno o más componentes de una mezcla sólida mediante un disolvente líquido.

Fases:__

1. Poner en contacto el sólido con el disolvente.__2. Separación del disolvente más soluto disuelto del resto del sólido (generalmente, mediante filtración).__3. Recuperación del soluto disuelto mediante técnicas como destilación o evaporación.-.-.-.Una variante de la extracción, que se utiliza para evitar el consumo de grandes cantidades de disolvente es la denominada extracción continua, que mediante unos dispositivos permite llevar acabo buenas extracciones, con pequeñas cantidades de disolvente. El sistema mas utilizado, es el Soxhlet. (ej. Extracción de grasas en alimentos).

Extracción líquido-líquido:

La sustancia a extraer se encuentra en una disolución liquida y se extrae mediante un disolvente líquido, inmiscible o poco soluble en la disolución.-.-.La forma más sencilla de efectuar una extracción en un laboratorio, es mediante una ampolla o embudo de decantación. Se agitan vigorosamente unos minutos la mezcla anterior, con la finalidad de poner en contacto la disolución y el líquido extractor. Después con la llave del embudo separaremos las dos fases.

5. DESTILACIÓN:


5.1 CONCEPTO:

¨Separación -por acción del calor- de un líquido volátil de una sustancia no volátil o de otro líquido cuyo punto de ebullición sea diferente, recogiendo los vapores tras su condensación.

5.2 FASES:

1º. El líquido alcanza el punto de ebullición y pasa al estado de vapor.

El líquido se condensa y es recogido en un recipiente apropiado.

5.3 TIPOS:


Simple:

Permite separar un líquido de un sólido o dos líquidos cuyo punto de ebullición difiera en más de 80ºC.

Fraccionada:

Se utiliza para separar mezclas de dos líquidos cuyo punto de ebullición es muy próximo.-.-.Para ello se repite varias veces el proceso obteniendo en cada una de ellas una mayor cantidad del líquido cuyo punto de ebullición es mayor.

5.4 DESCRIPCIÓN APARATO:

Matraz, refrigerante y recipiente colector.

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