Bioteknologia: DNAren Manipulazioa eta Analisia

gaia: Transformazioa: DNA bakterio-zeluletan sartzeko prozesua

Transformazioa gertatzea zaila da, DNA molekulak eta mintzeko fosfolipidoek karga negatiboa dutelako. Horregatik, aurretratamendu bat egiten da zelula konpetenteak lortzeko.

1) Zelula konpetenteak lortzea

• Pareta zelularra partzialki degradatu.
• Ioi positiboekin mintz plasmatikoaren karga neutralizatu, DNA errazago sar dadin.

2) Transformazioa behartzea

• Elektroporazioa: Eremu elektriko batekin poroak ireki. Efizientzia handia, baina garestia.
• Shock termikoa: Tenperatura aldatuz denbora tarte txiki batean. Zelula konpetenteak eta ligazio-nahastea izotzetan sartu 15-20 minutuz. Mintz plasmatikoaren mugikortasuna jaitsi eta karga negatibo eta positiboak elkartu egiten dira, poroak finkatuz. Ondoren, tenperatura bat-batean 37 ºC-ra igotzen da. Tenperatura-gradienteari esker, ligazio-produktua barneratzen da.

3) Nahasteari elikagaia gehitu

Ez du selektiboa izan behar, espresiorako eta erresistentzia garatzeko denbora behar duelako.

4) Transformanteen hautaketa

Transformazio-protokoloa bukatuta, transformatuak izan diren bakterioak hautatu behar dira. Plasmidoek selekzio-markadore bat izan behar dute; transformanteek aurrera egiten dute, besteak hil egiten dira.

5) Errekonbinanteen baieztapena

Transformanteak isolatu eta gero, errekonbinanteak direla baieztatu. Adibidez: ampizilina-medio batean biziraun, tetraziklinarekiko ez-erresistentea.

Bakteriofagoen DNA sarrera bakterioetan

1) Transfekzioa

Transformazioaren baliokidea da, baina plasmido bat erabili beharrean fago baten DNA erabiltzen da. Fagoaren DNA E. coli-ren zelula konpetenteekin nahasten da eta DNA errekonbinantearen sarrera “shock-termiko” bidez eragiten da. Efizientzia baxua du.

2) In vitro paketatzea

λ DNA molekula errekonbinanteak λ kapside eta beste osagai guztiekin paketatu saiodietan. λ-ren genomak kodifikatutako proteina jakin batzuk behar ditu. Efizientzia altuagoa du.

gaia: Azterketa automatizatuak

Mikroarray-ak

Hibridazio-esperimentu anizkoitzak egin ditzaketen miniaturizatutako gailuak. Geneen espresioa aztertzeko erabiltzen dira. Ez du RNA sekuentziarik lortzen, zunden erabileran oinarritzen da. Gen batetik bestera dagoen espresio-mailaren aldaketaren estimazio kuantitatiboa ematen du.

Illumina sequencing

1. Laginaren prestaketa: Tagmentazioa eta anplifikazioa.
2. Clusterra generatzea: Flowcell-ean, etiketen konplementarioak diren nukleotidoak. Bi norantzako sekuentziazioa.
3. Sekuentziazioa: Cluster bakoitzean emititzen den fluoreszentzia jasotzea. Luzera, hasiera/bukaera, introien posizioa eta mutazioak zehazten ditu. Garestiagoa da.
4. Datuen analisia: Ensanblajea. Mugak: Read oso motzak. Abantailak: Akats gutxi.

gaia: DNA erauzteko pausu orokorrak

1. Laginketa: Kultiboa edo listua.
2. Zelularen lisia: Pareta zelularra eta mintz plasmatikoa hautsi.
3. Proteinen degradazioa: Proteasa K entzima erabili.
4. Osagaien banaketa: Disolbatzaile organikoak (fenol) eta zentrifugazioa.
5. DNA-ren prezipitazioa: Etanola eta zentrifugazioa.
6. RNA-ren baztertzea: RNAasa erabiliz.
7. Kontzentratzea eta purifikazioa.
8. Baieztapena eta kuantifikazioa: Elektroforesi bidez.

gaia: Gene espezifiko baten klonajea

Hibridazio metodoak

Azido nukleikoen kate konplementarioak elkartzean datza. Sonda markatuak erabiltzen dira klonak identifikatzeko (erradiaktiboak edo ez-erradiaktiboak).

Inmunodetekzioa

Gen batetik eratorritako proteinaren detekzioan oinarritzen da, antigorputz primario eta sekundarioak erabiliz.

gaia: DNA-ren manipulazioa

Nukleasak

• Exonukleasak: Muturretako loturak degradatu.
• Endonukleasak: Kate barneko loturak degradatu (errestrikzio-entzimak).

Ligasak

Fosfodiester loturak sortu. DNA molekula ezberdinak lotzen dituzte (ertz kamutsak eta kohesiboak).

Polimerasak

DNA edo RNA molde batetik abiatuta, DNA kate berria sortu. Alderantzizko transkriptasa: RNA molde harturik cDNA sintetizatzen du (adibidez, VIH-ren mekanismoan).

Aldakuntza-entzimak

Fosfatasa alkalinoa, polinukleotido kinasa eta deoxinukleotidil transferasa terminala.

Topoisomerasak

DNA zirkularraren enroilamendua kontrolatzen dute.