Biotecnología microbiana: desregulación metabólica y producción industrial de metabolitos

Desregulación de vías metabólicas

En condiciones normales, el microorganismo produce solo la cantidad de metabolitos necesaria para crecer. En producción industrial se busca romper esa homeostasis, haciendo que más carbono, energía y poder reductor se dirijan hacia el producto deseado. Esto se logra modificando la cantidad o actividad de enzimas mediante mutaciones, cambios en promotores o modificaciones alostéricas. El resultado es la sobreproducción y acumulación del metabolito de interés.

Auxotrofía en rutas ramificadas

Se parte de un microorganismo que tiene una ruta metabólica ramificada donde los productos finales normalmente inhiben una enzima común. Se genera un mutante defectuoso en una de las ramas y se proporciona ese nutriente en una concentración limitante. Al no alcanzar el nivel necesario para formar el complejo inhibitorio, la enzima común permanece activa y el flujo metabólico se dirige hacia la otra rama, provocando la acumulación de su producto.

Análogos tóxicos de metabolitos

Se utiliza una molécula muy parecida a un metabolito normal. El análogo es reconocido por la enzima correspondiente, pero no puede funcionar como metabolito y puede inhibir la ruta o incorporarse de manera perjudicial a proteínas. Las células silvestres mueren, mientras que las mutantes resistentes poseen cambios en el sitio alostérico de la enzima. Esa enzima pierde sensibilidad al análogo y al metabolito regulador, por lo que la ruta permanece activa y el microorganismo excreta grandes cantidades del metabolito.

Ingeniería de promotores

Se modifica el ADN que controla la expresión de un gen. El promotor nativo puede sustituirse por uno constitutivo fuerte o inducible, aumentando la transcripción del gen y, posteriormente, la cantidad de enzima producida. Si además se elimina un gen represor, se elimina el freno de la ruta y aumenta todavía más la producción del metabolito.

Ingeniería de sitios alostéricos

Se modifican aminoácidos específicos del sitio alostérico de una enzima. La idea es conservar la capacidad de la enzima para reconocer su sustrato en el sitio activo, pero eliminar su afinidad por el metabolito que normalmente la inhibe. Así, aunque el producto se acumule, la enzima continúa funcionando y aumenta el flujo hacia el producto final.

Producción de ácido cítrico — Aspergillus niger

El microorganismo es Aspergillus niger y utiliza altas concentraciones de azúcares como fuente de carbono. La glucosa entra a la glucólisis, generando piruvato y posteriormente acetil-CoA. El acetil-CoA se condensa con oxalacetato mediante citrato sintasa, formando citrato. Al limitar el hierro, la aconitasa, que necesita Fe²⁺, queda inactiva y no puede convertir citrato en isocitrato; además, la PFK-1 permanece activa y mantiene un alto flujo glucolítico. Por eso el citrato se acumula y se recupera como ácido cítrico.

Pigmentos de Monascus

Monascus purpureus y Monascus ruber producen pigmentos llamados monascinas, pertenecientes a las azafilinas. La célula genera los intermediarios de una ruta híbrida y primero aparecen pigmentos naranjas, como rubropunctatina y monascorubrina. Estos pueden reaccionar con aminas primarias o grupos amino de proteínas, sustituyendo el oxígeno del anillo por nitrógeno y formando los pigmentos rojos, como rubropunctamina y monascorubramina. También se producen pigmentos amarillos como monascina y ankaflavina.

Astaxantina — Phaffia rhodozyma

La levadura Phaffia rhodozyma utiliza una fuente de carbono para generar los precursores necesarios para la síntesis de carotenoides. Bajo condiciones de estrés oxidativo, se activa la producción del pigmento y participa la enzima clave CrtS. La ruta conduce a la formación y acumulación de astaxantina, un carotenoide de color rojo-rosado. Para favorecer la producción se utiliza aireación constante y la acumulación de biomasa ocurre favorablemente alrededor de 20–22 °C.

C-ficocianina — Anabaena variabilis

La cianobacteria Anabaena variabilis sintetiza ficobiliproteínas, entre ellas la C-ficocianina. La célula sintetiza las proteínas que forman sus subunidades y posteriormente incorpora el cromóforo ficocianobilina (PCB), responsable de la coloración azul. El resultado es una proteína soluble en agua utilizada como colorante natural. Es estable aproximadamente entre 20–45 °C; por encima de 50–55 °C puede desnaturalizarse.

Glutamato monosódico — Corynebacterium glutamicum

En Corynebacterium glutamicum, la fuente de carbono entra al metabolismo central y genera α-cetoglutarato, intermediario del ciclo de Krebs. Se reduce la actividad del complejo α-cetoglutarato deshidrogenasa, evitando que el α-cetoglutarato continúe por el ciclo. De esta manera se acumula el precursor, que puede convertirse en L-glutamato mediante incorporación de nitrógeno. La desestabilización de la membrana favorece además su liberación al medio.

5’-GMP

Para producir 5’-GMP, se puede utilizar Corynebacterium ammoniagenes o Bacillus subtilis modificados. Primero se controla la ruta de purinas mediante una auxotrofía a adenina: al agotarse la adenina, disminuye la retroinhibición sobre PurF, permitiendo que se acumule 5’-IMP. Después, mediante una IMP deshidrogenasa desensibilizada (guaB) y sobreexpresión de GMP sintasa (guaA), el IMP se dirige hacia la formación de 5’-GMP.

Eritritol — Yarrowia lipolytica

En levaduras como Yarrowia lipolytica, las altas concentraciones iniciales de glucosa generan estrés osmótico. Como respuesta, el microorganismo produce eritritol. La ruta parte de D-eritrosa-4-fosfato, proveniente de la vía de las pentosas fosfato; esta molécula se desfosforila y después es reducida por una eritrosa reductasa dependiente de NADPH, formando eritritol.

Xilitol — Candida

Primero se utiliza biomasa vegetal rica en xilano, que se hidroliza para obtener D-xilosa. Después, levaduras del género Candida, como C. guilliermondii o C. tropicalis, realizan la biotransformación de la xilosa hacia xilitol. El proceso necesita condiciones microaerófilas: sin oxígeno no se regeneran adecuadamente los cofactores y con demasiada aireación el xilitol puede oxidarse a D-xilulosa mediante xilitol deshidrogenasa.

Manitol — Leuconostoc mesenteroides

Durante la fermentación heteroláctica, Leuconostoc mesenteroides utiliza la fructosa como aceptor alternativo de electrones. La enzima manitol deshidrogenasa reduce directamente la D-fructosa a D-manitol, utilizando el sistema de cofactores para regenerar NAD⁺.

Taumatina

La taumatina es una proteína dulce que puede producirse de forma recombinante en Pichia pastoris / Komagataella phaffii o Aspergillus oryzae. El microorganismo recibe el gen de la proteína y la expresa; posteriormente se requiere el procesamiento correcto de sus ocho puentes disulfuro, apoyado por la proteína disulfuro isomerasa (PDI), para obtener la conformación activa de la taumatina.

D-tagatosa

Primero se hidroliza la lactosa mediante β-galactosidasa, produciendo glucosa y D-galactosa. Después, la D-galactosa se somete a una isomerización reversible catalizada por L-arabinosa isomerasa, obteniendo D-tagatosa. En las diapositivas se mencionan enzimas recombinantes procedentes de microorganismos termófilos como Geobacillus stearothermophilus.

Isomaltulosa

Se utiliza sacarosa como sustrato. La enzima sacarosa isomerasa o isomaltulosa sintasa modifica el enlace glucosídico de la sacarosa y produce isomaltulosa. Puede realizarse mediante células inmovilizadas o extractos enzimáticos de microorganismos como Protaminobacter rubrum, Pantoea dispersa o Serratia plymuthica.

Jarabe de alta fructosa

Primero, el almidón de maíz se hidroliza mediante α-amilasa termoestable. Después, la glucoamilasa libera glucosa. Finalmente, la glucosa pasa por una columna con glucosa isomerasa, también llamada xilosa isomerasa, que transforma parte de la glucosa en fructosa, obteniéndose el jarabe de alta fructosa.

Goma xantana — Xanthomonas campestris

La bacteria Xanthomonas campestris utiliza principalmente glucosa o sacarosa como fuente de carbono. El carbono se convierte en precursores de azúcares activados que son ensamblados en unidades repetitivas de un polisacárido. Estas unidades forman una estructura ramificada que contiene glucosa, manosa y ácido glucurónico, y finalmente el polímero se secreta al medio como goma xantana.

Goma gelana — Sphingomonas elodea

Sphingomonas elodea utiliza glucosa como fuente de carbono. El metabolismo genera los precursores de azúcares necesarios para formar unidades repetitivas; posteriormente estas unidades se ensamblan y se secretan como un exopolisacárido, formando la goma gelana. Su unidad contiene glucosa, ácido glucurónico y ramnosa.

Síntesis de nisina — Lactococcus lactis

Lactococcus lactis produce inicialmente un péptido precursor codificado por nisA. Después, NisB y NisC realizan modificaciones postraduccionales mediante deshidratación y ciclación, formando la estructura característica del lantibiótico. NisT exporta el péptido y finalmente NisP elimina el péptido líder para activar la nisina. Los sistemas NisI/NisFEG protegen a la propia bacteria productora.

Acción de la nisina

La nisina llega a una bacteria Gram positiva y se une al Lípido II, molécula necesaria para formar el peptidoglucano. Varias moléculas de nisina y Lípido II se organizan formando poros en la membrana. Esto provoca pérdida de la fuerza protón-motriz, salida de iones y ATP y, finalmente, muerte celular.

Natamicina — Streptomyces natalensis

Streptomyces natalensis produce natamicina, un metabolito secundario con actividad antifúngica. La molécula llega a la membrana de hongos y levaduras y se une selectivamente al ergosterol. Esta interacción altera el funcionamiento de la membrana e inhibe el crecimiento del microorganismo fúngico.

Pediocina — Pediococcus acidilactici

Pediococcus acidilactici produce pediocina, una bacteriocina clase IIa. La molécula reconoce principalmente el receptor del sistema PTS de manosa presente en bacterias susceptibles como Listeria. La unión altera la membrana de la bacteria y provoca pérdida de su integridad, generando un efecto letal.

Riboflavina (B2) — Ashbya gossypii

La ruta de riboflavina converge a partir de GTP y ribosa-5-fosfato. En Ashbya gossypii, cuando se agotan los nutrientes necesarios para el crecimiento, el microorganismo entra en una fase donde sobreproduce riboflavina. Esta acumulación está relacionada con la respuesta al estrés oxidativo y la protección de las estructuras celulares. Industrialmente puede utilizar aceites vegetales como fuente de carbono.

Vitamina C — método clásico

La ruta comienza con D-glucosa, que mediante hidrogenación catalítica se convierte en D-sorbitol. Después, Gluconobacter oxydans fermenta el sorbitol y produce sorbosa. La sorbosa pasa por varias etapas químicas: protección con acetona, oxidación para formar un derivado de 2-ceto-L-gulónico y finalmente hidrólisis y lactonización para obtener ácido L-ascórbico (vitamina C).

Vitamina C — método moderno

Primero se obtiene sorbosa a partir de sorbitol mediante Gluconobacter oxydans. Después interviene Ketogulonicigenium vulgare, que oxida la sorbosa mediante SDH y posteriormente mediante L-sorbosona deshidrogenasa, acumulando ácido 2-ceto-L-gulónico (2-KGA). Finalmente, el 2-KGA se purifica y se transforma químicamente mediante esterificación y lactonización para producir ácido L-ascórbico.

Condiciones importantes para memorizar

Ácido cítrico — Aspergillus niger
pH: 1.8–2.5
Azúcares: 15–22 %
Proceso: aerobio estricto
O₂: pO₂ > 20 %
Morfología: pellets pequeños, lisos y compactos
Clave: limitar hierro.

Astaxantina — Phaffia rhodozyma
20–22 °C para acumulación de biomasa. Aireación forzada constante. Relacionada con estrés oxidativo.

C-ficocianina
20–45 °C: relativamente estable.
>50–55 °C: desnaturalización.
pH 5–7.5: rango de color azul brillante.

Xantana
28–30 °C.
pH 6.5–7.5
Glucosa/sacarosa: 3–5 %

Gelana
30–32 °C.
pH 6.5–7.0
Glucosa: 3–4 %

Edulcorantes: lo más importante

Polioles
* Eritritol → Yarrowia, Moniliella.
* Xilitol → Candida.
* Manitol → Leuconostoc

Intensos
* Taumatina → Thaumatococcus daniellii / producción recombinante.
* Monelina → Dioscoreophyllum cumminsii.
* Miraculina → Synsepalum dulcificum

Carbohidratos
* Jarabe de alta fructosa → glucosa isomerasa.
* D-tagatosa → L-arabinosa isomerasa.
* Isomaltulosa → sacarosa isomerasa

Preguntas de repaso

1. ¿Qué microorganismo produce ácido cítrico? Aspergillus niger.

2. ¿Cuál es la principal enzima cuya actividad se limita en la producción de ácido cítrico? La aconitasa, debido a la limitación de hierro, lo que favorece la acumulación de citrato.

3. ¿Qué cofactor necesita la aconitasa? Hierro, específicamente un centro hierro-azufre.

4. ¿Qué microorganismo produce astaxantina? Phaffia rhodozyma.

5. ¿Cuál es la enzima clave mencionada para astaxantina? CrtS.

6. ¿Qué microorganismo produce C-ficocianina? Anabaena variabilis.

7. ¿De qué molécula proviene el color azul de la C-ficocianina? De las ficocianobilinas, que son cromóforos unidos a la proteína.

8. ¿Qué microorganismo produce glutamato? Corynebacterium glutamicum.

9. ¿Qué enzima se reduce para favorecer la producción de glutamato? La α-cetoglutarato deshidrogenasa.

10. ¿Qué microorganismo produce xantana? Xanthomonas campestris.

11. ¿Qué microorganismo produce gelana? Sphingomonas elodea.

12. ¿Qué es un exopolisacárido? Es un polisacárido producido y secretado por un microorganismo al exterior de la célula.

13. ¿Qué bacteriocina actúa sobre el Lípido II? La nisina.

14. ¿Qué microorganismo produce nisina? Lactococcus lactis.

15. ¿Cuál es la diana de la natamicina? El ergosterol de la membrana de hongos y levaduras.

16. ¿Contra qué tipo de microorganismos actúa la natamicina? Principalmente contra hongos y levaduras.

17. ¿Qué microorganismo produce pediocina? Pediococcus acidilactici.

18. ¿Contra qué patógeno destaca la pediocina? Contra Listeria, especialmente Listeria monocytogenes.

19. ¿Qué microorganismo produce eritritol? Principalmente Yarrowia lipolytica en el material.

20. ¿Qué condición de oxígeno necesita la producción de xilitol? Condiciones microaerófilas, es decir, una cantidad limitada de oxígeno.

21. ¿Qué microorganismo produce xilitol? Principalmente levaduras del género Candida, como Candida guilliermondii.

22. ¿Qué microorganismos producen manitol? Bacterias ácido-lácticas heterofermentativas, como Leuconostoc mesenteroides.

23. ¿Qué enzima convierte fructosa en manitol? Manitol deshidrogenasa.

24. ¿Qué enzima se utiliza para producir D-tagatosa? L-arabinosa isomerasa.

25. ¿A partir de qué azúcar se obtiene la isomaltulosa? Sacarosa.

26. ¿Qué enzima produce jarabe de alta fructosa? Glucosa isomerasa, que convierte glucosa en fructosa.

27. ¿Qué microorganismo produce riboflavina? Ashbya gossypii y también Bacillus subtilis.

28. ¿Qué vitamina es la riboflavina? Vitamina B2.

29. ¿Qué microorganismo participa en el método clásico de producción de vitamina C? Gluconobacter oxydans, que convierte sorbitol en sorbosa.

30. ¿Qué microorganismo participa en el método moderno de vitamina C? Ketogulonicigenium vulgare, utilizado para producir 2-KGA.

31. ¿Qué significa desregulación metabólica? Es modificar o eliminar los mecanismos normales de regulación de una ruta metabólica para aumentar el flujo hacia el producto deseado.

32. ¿Qué es un análogo tóxico? Es una molécula parecida a un metabolito natural que puede inhibir o alterar una ruta metabólica, permitiendo seleccionar microorganismos resistentes que produzcan más del metabolito de interés.

33. ¿Qué es una auxotrofía? Es la incapacidad de un microorganismo para sintetizar por sí mismo un compuesto esencial, por lo que debe obtenerlo del medio.

34. ¿Qué función tiene un promotor? Controlar el inicio y el nivel de transcripción de un gen.

35. ¿Qué es la regulación alostérica? Es la regulación de una enzima cuando una molécula se une a un sitio alostérico, diferente del sitio activo, modificando su actividad.