Autoabsorcion en emisión atómica

4. CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN:

¨La cromatografía de partición o de reparto está basada en la separación de distintos solutos por su diferente SOLUBILIDAD entre una fase móvil y una estacionaria inmiscibles entre sí.

5. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD:

Se emplea este término para englobar aquellas técnicas que están basadas en mecanismos que implican AFINIDAD entre dos elementos, como enzima-sustrato, hormona-receptor, antígeno-anticuerpo.-.-.-.La fase estacionaria tiene unido el "ligando". Cuando pasa a través de ella la fase móvil con las sustancias a separar, aquellas que presenten interacciones específicas -afinidad- por el ligando quedaran retenidos en la fase estacionaria situada en la columna, siendo después eluídos con otros metabolitos que presenten mayor afinidad por el ligando o cambiando las condiciones físico-químicas de la fase móvil.

3. PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS

1.-¨FACTOR DE RETENCIÓN O RELACIÓN RESPECTO AL FRENTE DEL SOLVENTE (Rf):

En la cromatografía de papel o en capa fina se define una carácterística para cada sustancia en unas condiciones definidas, el Rf o factor de retención y corresponde a la relación entre la distancia desde el punto de aplicación al centro de la mancha (xn), y la distancia desde el punto de aplicación al frente del solvente (x).

Rf = xn / x __ xn = distancia recorrida por la sustancia separada x = distancia recorrida por el eluyente .-.-.-.El factor de retención se utiliza para identificar sustancias por comparación con el Rf de sustancias conocidas y determinadas en condiciones de trabajo idénticas.

2.-COEFICIENTE DE DISTRIBUCIÓN (Kd):

El coeficiente de distribución (Kd) es la relación entre la concentración molar de soluto en la fase estacionaria (FE) y la concentración molar de soluto en la fase móvil (FM)
, mostrando numéricamente la afinidad del soluto por las distintas fases. Cuanto mayor es Kd mayor es la proporción de soluto retenida por la fase estacionaria .

Kd = CFE / CFM

3.-VOLUMEN DE RETENCIÓN O VOLUMEN DE ELUCIÓN:

Para realizar una cuantificación por cromatografía es necesario ELUIR;

El volumen de elución es el volumen de eluyente que se necesita aplicar para que aparezca una sustancia en el cromatograma

-.-.-.El volumen de elución esta relacionado con el coeficiente de distribución mediante la siguiente fórmula:

Vr = Vm ( 1 + Kd)

Vr = volumen de retención o elución, Vm = el volumen de la fase móvil necesario para eluir un compuesto sin afinidad por la fase estacionaria (Kd=0) Kd = es el coeficiente de distribución.-.-.-.De esta manera, cuanto mayor sea el coeficiente de distribución de un soluto mayor será su volumen de retención.

4.-TIEMPO DE RETENCIÓN :

El tiempo de retención de un soluto es el tiempo al que éste sale eluido. El tiempo de retención (tr) y el volumen de retención están relacionados mediante:

Vr = tr . F donde F es la velocidad de flujo (ml/min) de la elución) .-.-.-.El volumen de retención y el tiempo, trabajando en condiciones constantes y empleando patrones pueden servirnos para identificar sustancias.

5.-SELECTIVIDAD (S, &):

Es el factor que describe la capacidad para separar 2 solutos -
A y B-, es decir, la relación entre los coeficientes de distribución de ambos -Kd A y Kd B-.

& = Kd B / Kd A

Expresa el número de veces que un elemento es más afín que otro para una misma fase móvil y estacionaria.

6.-RESOLUCIÓN O CAPACIDAD DE SEPARACIÓN:

En un cromatograma, tras la elución y lectura de las fracciones, aparecen representadas en PICOS cada una de las sustancias separadas.-.-.-.El objetivo es que las sustancias queden separadas lo mejor posible, a esta capacidad de la técnica cromatográfica es lo que denominamos resolución.-.-.-.Si medimos las distancias entre el centro de dos picos del cromatograma desde un punto de referencia (d) y el ancho de la base de cada pico (a) podemos calcular la resolución mediante la fórmula:

R=d2-d1 / 1/2 (a2+a1)

.-.-.-.Las distancias (d) pueden ser medidas como tiempos
- el transcurrido hasta el máximo del pico-, volúMenes
-de retención de la sustancia- o como distancias
..--..--..Se requiere un valor mínimo de R = 1'25 (la resolución no tiene unidades de medida), para considerar una buena separación cromatográfica..--..--..En un cromatograma en papel o en capa fina, idealmente, las manchas deben ser circulares, y la resolución dependerá del diámetro de las manchas y la distancia entre el centro de éstas. En este caso, se define como el cociente entre la distancia que separa dos manchas y la media del diámetro de estas manchas.-.-.-.Igualmente se puede calcular, a partir del cromatograma, el coeficiente de distribución y la selectividad por las ecuaciones:

Kd = Vr - Vo / Vo = tr - to / to

..

& = Kd2 / Kd1 = V1 -Vo / V1 - Vo

-.-.-.Vo = volumen de exclusión ( volumen en el que sale un soluto no retenido) Vr = volumen de elución (volumen de retención) Kd = coeficiente de distribución .-.-.-..-.-.-.Para valorar el control del diabético se realiza la determinación de glucosa en plasma y orina, pero solo reflejan las variaciones agudas y no son indicadores adecuados a largo plazo del control del diabético..-.-.-.La identificación de la hemoglobina A1c, hemoglobina A con un residuo de glucosa sobre la valina aminoterminal de la cadena â, tiene utilidad en la evaluación del control del diabético ya que se forma a partir de la hemoglobina A a una velocidad constante durante el intervalo de 120 días de vida del hematíe. Los niveles de la hemoglobina A1c corresponde al 3-6 % del total de la hemoglobina total de los individuos normales pero en los diabéticos puede aumentar si no es correctamente contralada su glucemia.

TEMA 5. ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA (FLUORIMETRÍA):

1. FUNDAMENTO:

La fluorescencia es un proceso de EMISIÓN atómica y/o molecular, se produce cuando ciertas moléculas absorben luz de una determinada longitud de onda (l1), y emiten luz de una longitud de onda superior a la absorbida (Yreves2), es decir, de menor energía.-.-.-.La intensidad y el color de la luz emitida son carácterísticos de la sustancia fluorescente y no tiene, necesariamente, el mismo color que la luz absorbida.

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Cuando un haz de luz de una determinada intensidad y energía (luz cercana al espectro ultravioleta -rojo-) incide sobre el material fluorescente, sus moléculas absorben esta energía y se produce el paso de sus electrones a orbitales más externos y más energéticos. Las moléculas, que se encuentran en estado excitado, emiten esta energía cambiando la longitud de onda de parte de la energía recibida en forma de luz originando una emisión fluorescente o fluorescencia (su espectro de emisión) quedando en su estado basal o de reposo.

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La luz emitida en la fluorescencia tiene menor energía que el haz de luz incidente, por lo tanto, la luz emitida es de longitud de onda mayor que la correspondiente a la radiación absorbida o de excitación.-.-.-.-.La absorción de energía por la materia se produce en 10-15 s mientras que la emisión de energía en la fluorescencia es de 10 -8 y 10 -4 s; se produce un retraso de la emisión fluorescente respecto a la absorción de energía siendo, por tanto, un fenómeno más lento.-.-.-.Inicialmente, la fluorimetría se utilizó para cuantificar sustancias que presentaban fluorescencia natural -fluorocromos- como las vitaminas para, posteriormente, aplicarse a moléculas que adquieren esta propiedad al hacerlas reaccionar con productos fluorescentes.

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La FLUORIMETRÍA es una técnica de laboratorio que permite determinar el tipo y la intensidad de una radiación fluorescente emitida por una sustancia que previamente ha sido sometida a la acción de una radiación de determinada /l. Por tanto, el cálculo de la luz fluorescente emitida permite realizar el análisis cualitativo y cuantitativo del compuesto que la emite. Es una técnica sencilla (como otras técnicas fotométricas) y con una alta sensibilidad y especificidad.
Las determinaciones fluorimétricas pueden ser:--

Directas:

se mide la fluorescencia de un compuesto (reactivo + analito).--

Indirectas:

miden el aumento o disminución de la fluorescencia del analito cuando reacciona con los reactivos.

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La FOSFORESCENCIA es aquel fenómeno luminiscente que se produce tras la irradiación de la materia debido a la capacidad de la sustancia de almacenar la energía y posteriormente emitirla en forma de radiación.Se mantiene durante un tiempo que oscila desde unos pocos segundos hasta minutos o incluso horas. La fluorescencia difiere en que la emisión de la energía es inmediatamente, no se almacena.-.-.-.

La QUIMIOLUMINISCENCIA es un fenómeno luminiscente que se produce en el transcurso de una reacción química.

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La relación entre la concentración y la intensidad de emisión fluorescente se deduce a partir de la ley de Lamber-Beer.

Ie/I0=10-ebc

I_e:intensidad emitida.

Io:

intensidad de luz incidente.

e:

coeficiente de extinción molar b=trayecto óptico c=concentración ^._____
Llamaremos rendimiento cuántico
Omega de la fluorescencia a la relación entre el número de moléculas que emiten fluorescencia y el número total de moléculas excitadas.-.-.-.También se puede definir como la relación entre los fotones emitidos (Ie) y los absorbidos (Io), pudiendo variar el rendimiento desde __cero -sustancias no fluorescentes-, __hasta cerca de la unidad ,fluorescencia máxima-.

Omega= Ie / Io

-.-.-.Como la fluorescencia es una técnica cuantitativa, la intensidad de la radiación fluorescente (F)


es proporcional a la intensidad del haz de excitación que es absorbida y al rendimiento cuántico:

F = Omega (Io - Ie)

Relaciónándolo con la ley de Lamber-Beer resulta:

F =Omega Io (1 - 10- ebc)

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Si ponemos como condición de trabajo utilizar soluciones diluidas para que no se absorba más que el 2% de la radiación incidente -por encima de esta absorbancia, no son iluminadas por igual todas las partes de las solución producíéndose un efecto de filtro interno por la propia solución y, por tanto, la emisión de fluorescencia es diferente en las distintas capas de la solución-, la ecuación anterior queda:

F = k × c

Dónde k es una constante __del instrumento -
La fluorescencia es emitida en todas las direcciónes, pero sólo una parte llega al fotomultiplicador- y __de la sustancia-
Rendimiento cuántico, F-.-.-.-.De esta fórmula se deduce que la intensidad de la luz fluorescente será proporcional a la concentración de sustancia en solución.-.-.-.La fluorimetría es una técnica sencilla (como otras técnicas fotométricas) y con una alta sensibilidad y especificidad que le confiere la propiedad de la fluorescencia

2. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA FLUORESCENCIA Y FOSFORECENCIA:

Rendimiento cuántico de la fluorescencia -

la relación entre el número de moléculas que emiten fluorescencia y el número total de moléculas excitadas o la relación entre los fotones emitidos (Ie) los absorbidos (Io)-.-.-.-.

Tipo de transición de relajación entre niveles (orbitales).-.-.-.

Estructura molecular

Los compuestos aromáticos, son los que presentan mejor fluorescencia ya que la rigidez estructural favorece la fluorescencia-.-.-.-.

Condiciones de medida.:__

La temperatura de medida y la presencia de compuestos pesados en el disolvente se relacionan de forma inversa con la fluorescencia.__Con respecto al pH, la fluorescencia es diferente dependiendo de la ionización que presenten sus radicales ácidos o básicos.__La presencia de oxígeno disuelto, reduce la intensidad de la fluorescencia.__La potencia de la fluorescencia suele ser lineal a bajas concentraciones de la especie fluorescente, perdíéndose la linealidad al aumentar la concentración.

3.INSTRUMENTACIÓN:

Para medir la fluorescencia emitida por una sustancia sobre la cuál previamente ha incidido una luz de determinada longitud de onda, se pueden emplear FlúorÍMETROS
-
Utiliza filtros como sistema de selección de longitud de onda- o ESPECTROFLUORÍMETROS
-
Emplea prismas o redes de difracción- para la selección de la longitud de onda tanto de la luz incidente como de la luz emitida. Generalmente tienen óptica de doble haz para compensar posibles variaciones de potencia de la lámpara.____________1. Fuente de luz de excitación:


se emplean lámparas de arco de xenón que emiten luz de amplio espectro (250-800nm) o lámparas de Mercurio, más prácticas porque emiten líneas de alta intensidad en el rango de las longitudes de onda de excitación apropiadas. Se utiliza también el láser de nitrógeno.

2. Rendijas de excitación (a) y emisión (b):

son similares a las de los espectrofotómetros.

3. Monocromador de excitación (a), emisión (b):

que tienen como finalidad seleccionar la longitud de onda de excitación adecuada y eliminar las longitudes de onda no deseadas emitidas (procedentes de las reflexiones y dispersiones) antes de llegar al detector. Pueden ser filtros de vidrio o filtros de interferencia -flúorómetros- y prismas o redes de difracción -espectrofluorómetros-.

4. Cubeta para muestras:

pueden ser de sílice o de cuarzo. No se pueden utilizar las de plástico pues pueden originar una fluorescencia adicional y el método pierde sensibilidad

.

5. Sistema de atenuación

el haz de referencia atraviesa el sistema de atenuación que reduce la potencia del haz hasta valores similares a los de la emisión fluorescente.

6. Detector de la muestra (6) y detector de referencia (7):

son, como en los espectrofotómetros, tubos fotomultiplicadores que permiten multiplicar y cuantificar la señal fluorescente. El monocromador de emisión y el fotomultiplicador se sitúan en un ángulo de 90º respecto a la energía incidente para evitar que incida luz procedente de la lámpara.

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-__La radiación atraviesa el monocromador de excitación separándose en dos al incidir sobre un espejo.__Parte de la radiación atraviesa la cubeta con la muestra llegando al monocromador de emisión y al detector.__El haz de referencia atraviesa el sistema de atenuación y el monocromador de emisión de referencia hasta detector de referencia.__El procesador mide la relación existente entre la intensidad de la radiación emitida por la muestra y la de referencia obteniendo un dato numérico.

4. ASPECTOS PRÁCTICOS:

Las determinaciones fluorimétricas pueden ser:

Directas:

se mide la fluorescencia de un compuesto (reactivo + analito).

Indirectas:

miden el aumento o disminución de l a fluorescencia del analito cuando reacciona con los reactivos.-.-.-.En bioquímica se aplican estos métodos para el análisis de alimentos i fármacos.-.-.-.En bioquímica clínica se aplican para la determinación en muestras biológicas de iones, enzimas, coenzimas, vitaminas, algunos medicamentos, etc.

4.1 Sensibilidad y especificidad

Es una técnica entre 100 y 1000 veces más sensible que las colorimétricas ya que en las medidas de absorción la sensibilidad de la medida depende de la proporción de luz absorbida que a su vez depende de la cantidad de cromógeno y de la longitud de paso de luz, y en las medidas de fluorescencia la sensibilidad depende además de estos factores de la intensidad de la fuente de luz.

4.2 Medida de la fluorescencia:

La medida de fluorescencia se expresa en unidades de intensidad relativa, pues la intensidad medida no es una cantidad absoluta.-.-.-.-.Las variaciones en las intensidad de radiación hacen necesario el calibrado diario del flúorímetro o del espectrofluorímetro; para ello se emplea una solución estándar de fluorescencia conocida (el sulfato de quinina 10- 5M absorbe a 350 nm y emite radiación a 450 nm).-.-.-.-.Los factores que producen esta variabilidad son:--la intensidad de luz incidente--la cantidad de luz captada por el detector--el ancho de banda del haz de energía radiante analizada y --la eficacia del detector _____
Las variaciones en las intensidad de radiación hacen necesario el calibrado diario del flúorímetro o del espectrofluorímetro; para ello se emplea una solución estándar de fluorescencia conocida (el sulfato de quinina 10- 5M absorbe a 350 nm y emite radiación a 450 nm).-.-.-.-.Para hacer el blanco de reactivo, solo se puede establecer el cero o fluorescencia nula, no existe equivalente para establecer el 100% de absorción, por lo que la señal electrónica variará para la misma concentración de sustancia de un instrumento a otro y no se podrán comparar. Esto es importante a la hora de realizar controles de calidad, pues no se pueden realizar controles externos.

4.3. Cubetas:

A parte de lo que ya hemos comentado anteriormente que tienen que ser de sílice o de cuarzo, éstas no deben presentar rayaduras, porque aumentan la dispersión de la luz; no deben tener marcas de dedos porque se puede producir fluorescencia contaminante o absorción de luz; y se no deben de limpiar con detergentes fluorescentes -se pueden limpiar con ácido nítrico en caliente-.

4.4. Condiciones que influyen en la determinación:

Condiciones a tener en cuenta en la señal fluorescente de un compuesto son:--solvente --pH --temperatura --absorbancia de la luz por la solución --presencia de interferentes que pueden provocar una fluorescencia no deseada --compuestos que atrapan la luz "atenuación de la fluorescencia o quenching" debido a la transferencia de la energía de una molécula a otra en la solución y por tanto la perdida de la energía en forma de calor.-.-.-.-.-.La temperatura de la medición se relaciona de forma inversa con la fluorescencia mientras que la viscosidad del disolvente lo hace de forma directa.
El pH influye en la fluorescencia de una molécula debido al grado de ionización que presenten sus radicales.

4.5 Aplicaciones

Se emplean para la determinación directa de:

SUSTRATOS

Catecolaminas,protoprofirinas,estrogenos urinarios.

ENZIMAS:

oxidoreductasa,glucoxidasas,glucosidasa,peroxidasas.Fármacos:fenitoina,fenobarbital.-.-.-.-Aunque su gran aplicación es el FLUOROINMUNOANÁLISIS, en el que se emplean anticuerpos monoclonales marcados con una sustancia fluorescente, específicos de la sustancia a estudiar, convirtiéndose esta técnica en una de las alternativas más importantes al radioinmunoanálisis. Se han desarrollado una variada cantidad de técnicas y aparatos basados en la fluorescencia.
_____¨Los métodos analíticos fosforimétricos, se emplean en la determinación de ácidos nucléicos, aminoácidos, pirinas, enzimas, etc. No se emplea tanto como la fluorimetría porque a pesar de su elevada selectividad, presenta mayor imprecisión y más inconvenientes en la medida.-.-.-.-.Ambas técnicas, la fluorimetría i i la fosforimetria, se emplean como complemento a las técnicas de cromatografía líquida de elevada resolución (HPLC -high performance liquid chromatography) al detectar los componentes luminiscentes que son eluidos a través de una columna cromatográfica.

TEMA 6:ESPECTROSCOPIA DE EMISIÓN ATÓMICA: FOTOMETRÍA DE LLAMA:

1. INTRODUCCIÓN:

La mayoría de las técnicas espectroscópicas se utilizan para el estudio y caracterización de MOLÉCULAS o IONES en su entorno (resto de componentes de la muestra).-.-.-.-.
La ESPECTROSCOPÍA DE EMISIÓN Y ABSORCIÓN ATÓMICA se usa casi exclusivamente para el análisis de ÁTOMOS siendo la técnica de elección como método de análisis elemental de metales.-.-.-.-.En principio, la espectroscopía de emisión puede utilizarse para la IDENTIFICACIÓN (emisión de ë carácterísticas de cada elemento) y para la determinación CUANTITATIVA (intensidad de las líneas espectrales de la emisión) de todos los elementos de la tabla periódica aunque su empleo se limita a unos 70 elementos (las líneas de emisión de algunos corresponden a la regíón del ultravioleta de vacío siendo la intrumentación necesaria poco accesible a los laboratorio de LAC)

______

Cuando se produce la transición de los átomos de un elemento desde su estado fundamental (A0

hasta un estado excitado (A

Mediante la absorción de una radiación determinada y carácterística para los átomos de este elemento y cuantificamos la radiación ABSORBIDA, estamos en el caso de LAS TÉCNICAS ESPECTROFOTOMÉTRICAS DE ABSORCIÓN
.
-.-.-.-.En el caso en que los átomos se lleven previamente a un estado excitado midiendo la intensidad de la radiación EMITIDA por los átomos -con la frecuencia carácterística correspondiente a la transición desde el estado excitado al estado fundamental- hablamos DE TÉCNICAS ESPECTROFOTOMÉTRICAS DE EMISIÓN
.

_____

La ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA se basa en el fenómeno de ABSORCIÓN de luz por un átomo que se encuentra en su estado basal o fundamental que origina el desplazamiento de sus electrones a niveles orbitales más energéticos y, por lo tanto, menos estables. Los átomos excitados tienden a recuperar su estado basal, menos energético, emitiendo la energía absorbida como una radiación electromagnética de longitud de onda semejante a la radiación absorbida y carácterística de cada elemento.-.-.-.-.En la espectrofotometría de absorción atómica, el elemento a analizar debe encontrarse en un estado atómico neutro -no excitado ni ionizado-. La obtención de átomos en estado basal a partir de la muestra -PROCESO DE ATOMIZACIÓN- se puede obtener de varias formas las cuales dan nombre a la técnica:___Espectroscopia de absorción atómica con atomización de llama (F-AAS: Flame Atomic Absorption Spectroscopy).____Espectroscopia de absorción atómica con atomización electrotérmica o cámara de grafito (GF-AAS: Grafite Furnace Atomic Absorption Spectroscopy)