Apuntes electroforesis capilar inyección hidrodinámica

ELECTROFORESIS

1, Definición
Es el desplazamiento, migración o transporte de partículas
cargadas eléctricamente en el seno de una masa líquida, bajo la acción de un
campo eléctrico.
2. Repaso
electricidad
Diferencia entre estática y corriente eléctrica.
Comparar fuerzas gravitatorias y electromagnéticas:
3. Movilidad
electroforetica
Definimos movilidad electroforética: u = v/E como la
velocidad de desplazamiento con la que se mueve una partícula bajo la acción de
un campo eléctrico con un gradiente de de potencial de
La movilidad electroforética será una carácterística de cada
sustancia en unas condiciones ambientales (pH) 
ya que determinará la carga de las partículas, siendo independiente del
campo eléctrico ya que al variar este variará proporcionalmente la velocidad de
migración.
4. Factores que
influyen
Los principales parámetros 
que afectan en el desarrollo de una electroforesis y   que condicionan su utilidad en el laboratorio,
son:

• La

• carga neta

• La

• fuerza iónica.

• La

• estructura y el tamaño de las moléculas.

• El

• potencial y  La intensidad de

• corriente

• El

• soporte

• El

• revelado.

• Evaporización  del tampón con lo que la concentración

• del tampón aumenta y la velocidad disminuye.

• Desnaturalización

• de las partículas (aminoácidos de las proteínas por ejemplo).

• soportes

• no restrictivos

• soportes

• restrictivos                      (mirar la fotocopia del final del tema)

• Isoelectroenfoque

• Inmunoelectroforesis

• Electroforesis

• de flujo libre.

• Electroforesis

• capilar.

• SDS-

• PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante.

• Electroforesis

• bidimensional.

• Electroforesis

• en gel de gradiente.

• Electroforesis

• en campo pulsante.

11. Isoelectroenfoque

• Colocar

• la muestra

• Aplicar

• el campo eléctrico

• Separación

• de los componentes.

• gran

• poder de amortiguación

• una

• conductividad eléctrica uniforme.

• baja

• absorbancia

• Anfolinas

• que son mezclas de tampones poliaminopolicarboxilicos. Estos tampones

• después de introducirlos en la cubeta hay que esperar un tiempo (1 hora)

• hasta que se producta el gradiente de pH 

• porque sino se produce el efecto meseta.

• Inmovilinas

• son copolímeros insolubilizados dentro del gel de poliacrilamida de

• manera que se forma el gradiente de pH y el gel al mismo tiempo

12. Electorforesis de flujo

12. Libre

13. Electroforesis capilar

Entre las ventajas que ofrece la
electroforesis capilar se puede apuntar que da lugar a separaciones con volúMenes de muestra extraordinariamente pequeños
de muestra extraordinariamente pequeños
de muestra extraordinariamente pequeños (de 0,1 a 10 nL), con una
elevada resolución y rapidez.

• La

• electroforesis capilar en gel: combina la técnica de electroforesis con la

• cromatografía de reparto. Permite la separación en función de la migración

• electroforética y también en función del peso molecular de las muestras.

• Electroforesis

• capilar de zona:. Está basada en la separación de los analitos según la

• relación carga/tamaño.

• Enfoque

• isoeléctrico.

• La

• isotacoforesis significa electroforesis a velocidad uniforme. Es una

• técnica de separación por desplazamiento.

• La

• electrocromatografía capilar es un híbrido entre la HPLC y la CE.

14.  Electroforesis en gel

1.  Electroforesis en gel de poliacrilamida

1. (PAGE)

2. Electroforesis en geles de

2. agarosa

3. La

3. electroforesis bidimensional se basa en separar las proteínas en una

3. mezcla según sus dos propiedades moleculares, una en cada dimensión. El

3. procedimiento más usado se basa en la separación en una primera dimensión

3. mediante isoelectroenfoque y la segunda dimensión según peso molecular

3. mediante electroforesis en poliacrilamida.

3. Electrofóresis en geles de

3. gradientes

5. electroforesis de campo

5. pulsante (o Pulsado, pulsed-field gel electrophoresis , PFGE).

5. pulsado, pulsed-field gel electrophoresis , PFGE).

5. pulsado, pulsed-field gel electrophoresis , PFGE).

Los dos primeros están relacionados con el pH
y  por lo tanto con el tampón.
 
La carga neta:
Según las distintas constantes de equilibrio de las partículas, el grado de
ionización de las mismas varía  en
función del pH de la disolución. (+ ó – según el punto isoeléctrico). Esto se
controla habitualmente con la utilización de una disolución tampón, que en el
caso de las proteínas es básico, de tal manera que la mayoría de las proteínas
tienen una carga negativa.
Los puntos isoeléctricos de los Aa varían entre 3 y 10. En
disoluciones muy ácidas los Aa aparecen como cationes y en disoluciones muy
básicas aparecen como aniones.

La fuerza iónica:
I= ½ sumatorio concentración·carga²
En un proceso electroforético, la corriente eléctrica es
transportada por todos los iones presentes. En cantidad  total hay más carga en las moléculas del
tampón Cuando más concentrado sea este mayor es la proporción de corriente
transportada por este y menor la transportada por la muestra por lo que el
proceso será más lento.
Por lo que la disolución tampón tiene, aquí, mucha
importancia.

La estructura y Tamaño de las partículas
tamaño de las partículas
tamaño de las partículas: Es importante cuando el soporte
permite el paso selectivo de moléculas por tamaño. De todos modos, este hecho
no tiene que ser negativo sino que, permite separar distinto tipo de
partículas.
No existe ningún soporte que sea estrictamente no
restrictivo.

Potencial del campo
eléctrico:
A mayor potencial eléctrico mayor movilidad  o lo que es lo mismo mayor velocidad de
migración. Sin embargo, un mayor potencial implica un aumento de la temperatura
que conlleva dos consecuencias no deseables:

5. Tipo de
electroforesis
Tradicionalmente se dividen en dos bloques: de interfase
libre o de zona.
 
Interfase libre
En un tubo en forma de U se introducen las sustancias a
separar. Los extremos se conectan a los electrodos y se produce la separación
de las partículas hacia los dos electrodos. Aunque fue el primer método, hoy en
día no se suele utilizar porque no define bien la separación entre las
distintas partículas.
 
Electroforesis de
zona
En estas electroforesis la muestra se desplaza  en un medio líquido adsorbido sobre un
soporte. Según este soporte se clasifican en:
ØNo Restrictivos:
restrictivos:
restrictivos: Las sustancias que se depositan en ellos se pueden mover
libremente por lo que la separación tiene lugar únicamente debido a su carga
eléctrica
·Papel
·Acetato de celulosa: se utiliza en forma
de tiras que están formadas por fibras de este compuesto y que engloban aire
entre ellas. Cuando se van a usar se sumergen en el tampón de tal forma que
éste ocupa los huecos. El tampón es el encargado de transportar la corriente
eléctrica a través de la tira.

Ventajas:

es de fácil manejo, de fácil lectura, son de rápida ejecución y son económicos.
·Gel de agarosa: se utiliza a una
concentración de entre 0,5-1 gramos por 100 cm³ de tampón. Su
aspecto es claro y transparente y se puede medir por fotodensitometría.
ØRestrictivos:
El soporte ejerce algún tipo de impedimento al desplazamiento de las partículas
de la muestra. Este desplazamiento depende del tamaño del poro del gel y, por
lo tanto, del tamaño de las partículas. Hay dos tipos fundamentales:
·Gel de almidón: Tiene como ventaja que
aumenta el número de fracciones separadas. Tiene muchos inconvenientes: preparación
extratemporánea del gel, preparación complicada para obtener una capa de
espesor  y porosidad uniformes,
prácticamente imposible medir por densitometría,...
·Gel de poliacrilamida: Es el soporte
ideal si se quieren conseguir más y mejores separaciones electroforéticas.   Son el
resultado de la polimerización de la acrilamida con diferentes compuestos. Proporcionan
más fracciones y mejor resolución de las bandas. El tamaño del poro se puede
variar cambiando la composición del gel.
6. Proceso e
instrumental
§Preparación De la muestra:
de la muestra:
de la muestra: Las principales muestras son suero, plasma, sangre total,
orina, líquido cefalorraquídeo,...
Suero y plasma no
suelen necesitar preparación. Para la electroforesis de hemoglobina hay que
utilizar un hemolizado de hematíes. Para la de proteínas urinarias se utiliza
una orina que se debe preparar mediante concentración, etc.
§Selección Del soporte:
del soporte:
del soporte:
§Aplicación De la muestra:
de la muestra:
de la muestra: Se puede aplicar según tres técnicas:
oAplicación
sobre la superficie del soporte dejando que la muestra penetre Practicar
orificios o ranuras en los geles  Incluir
la muestra en el proceso de polimerización del gel.
oProceso Electroforético:
electroforético:
electroforético: Se requiere una instrumentación:
oFuente De alimentación
de alimentación
de alimentación: se usa para aportar la energía eléctrica al proceso.
oCubeta:
consiste en una cámara que contiene los electrodos de carga opuesta. Los
electrodos están situados en dos receptáculos separados entre sí que se
conectan por un puente salino cuya función es permitir el paso de la corriente.
La cubeta se encuentra tapada para minimizar la evaporación. En algunos casos
lleva un sistema de refrigeración.

oRevelado:
Tiene por objeto la localización de las distintas fracciones de la muestra.
Esto se consigue mediante la tinción de la tira. Previamente a este paso se
debe parar el proceso de difusión que se consigue con distintos métodos. El
colorante empleado dependerá del compuesto que queramos localizar . Una vez
sumergida la tira en el colorante se debe eliminar el exceso mediante lavados
con una solución aclarante.
oLectura Y evaluación:
y evaluación:
y evaluación: Se puede leer de distintas formas:
1.Elución:
Cada zona se recorta y se eluye en un disolvente adecuado al colorante. Se
obtiene así unas disoluciones coloreadas que se miden en el espectrofotómetro.
2.Densitometría:
Consiste en la lectura directa de la tira mediante un fotodensitómetro. En este
aparto se elige la longitud de onda adecuada, se hace pasar un haz de luz a
través de la tira y, dependiendo de la densidad de color de cada fracción se
absorberá más o menos luz. Un detector recibe el haz de luz y dependiendo de la
intensidad de la luz recibida se determina la concentración. El aparato es
capaz de elaborar una gráfica de registro del recorrido de la luz. En esta
gráfica, cada banda aparece como un pico cuya altura depende de la densidad de
color que a su vez depende de la concentración de la sustancia.
3.Escintilometría
: cuando la muestra presenta radiactividad.
4.Identificación Por fluorescencia
por fluorescencia
por fluorescencia.
7. Aplicación de
electroforesisLas electroforesis se 
utilizan para el análisis de proteínas, ADN y ARN, antibióticos,
vacunas,… utilizándose los distintos soportes.
Compuestos separados                      medio de soporte
de soporte
de soporte
Aminoácidos                                     papel,
acetato de celulosa
Proteínas séricas                                acetato
de celulosa /   Gel de poliacrilamida
Lipoproteínas                                    acetato
de celulosa. Agarosa
Glucoproteinas                                  agarosa
Ácidos nucléicos                               agarosa   poliacrilamida
Hemoglobinas                                    acetato
de celulosa
Isoenzimas:                                      
Vamos a describir
varias:
En la electroforesis
en acetato de celulosa  se separan
las proteínas séricas. Salvo la albúmina cada fracción está formada por un
conjunto de proteínas con una movilidad semejante pero con distintas
estructuras y funciones. Valores normales: La fracción de albúmina es la que
más migra respecto al punto de aplicación
En el caso de utilizar plasma entre las beta y las gamma
aparece el fibrinógeno. Con agarosa las betas se desdoblan en 1 y 2.  (mirar Cuadro del final del tema)
cuadro del final del tema)
cuadro del final del tema)

El gel de agarosa. Se usa en la separación de las
lipoproteínas,  isoenzimas, en la
inmunoelectroforesis y separación de fragmentos de ADN grandes.
La Electroforesis En gel de poliacrilamida
en gel de poliacrilamida
en gel de poliacrilamida se usa para la separación de isoenzimas de la
fosfatasa alcalina, para determinar pesos moleculares de proteínas y para
investigación de fragmentos de ADN pequeños.
El Isoelectroenfoque
se utiliza para el estudio de las inmunoglobulinas y para estudiar algunos
isoenzmas.
8. Consideraciones
prácticas de la electroforesis
·Problemas
con el tampón:
El tampón se contamina muy fácilmente y, para
evitarlo, se debe guardar refrigerado. Si el volumen de tampón utilizado es
pequeño se deberá desechar, mientras que si es grande se deberá guardar en una
botella a 4ºC.
·Fuente
de alimentación y cubetas:


oLa
cubeta debe estar en posición horizontal con los dos receptáculos de tampón
nivelados y llenos por igual.
oLos
dos extremos del puente salino deben estar bien impregnados en tampón.
oLas
cubetas se deben mantener limpias y siempre tapadas.
·Aplicación
de la muestra:
Los aplicadores deben estar perfectamente limpios antes
de cada uso y hay que respetar la cantidad de muestra de la técnica indicada.
·Voltaje
y calentamiento:
Si se incrementa el voltaje se incrementa la movilidad
de las partículas pero se genera un calentamiento. Este calentamiento puede
traer como efecto no deseado la aparición de “bandas arqueadas” debido a la
desecación de los bordes de la tira que hace que en ellos la movilidad sea más
lenta.
·Tinción
y lectura:
La tira debe tener un fondo transparente y uniforme, para
poderla leer por fotodensitometría.
10. Otras
técnicas electroforéticas
Ya hemos visto
una clasificación histórica de las electroforesis que nos ayuda a entender la
técnica. Sin embargo, hoy en día resulta más práctico detallar las distintas
electroforesis en función del soporte, el voltaje  y los requerimientos para su realización.
Algunas de ellas las vamos a desarrollar en este tema y otras las dejamos para
otro módulo.

Definición  de isoelectroenfoque

Es una técnica parecida a la electroforesis normal (por
ejemplo para la determinación de proteínas séricas) que tiene la peculiaridad
de presentar un gradiente de pH debido a la composición de su tampón.
Cuando el elemento a separar migra hacía uno de los
electrodos, llegará un momento en el transcurso de su recorrido en que se
hallará situado en una zona cuyo pH será igual al pI. En ese momento, éste
dejará de migrar, puesto que tendrá carga eléctrica nula.
La ventaja que tiene sobre la electroforesis normal es que
no tiene el problema de la difusión permitiendo unas resoluciones más
definidas, separando incluso compuestos con diferencias de pI de 0,2.
El inconveniente principal es que requiere diferencias de
potencial muy altas (del orden de 2000 voltios) lo que hace que se deban
refrigerar los instrumentos para evitar el acúmulo de calor.
 Pasos:
Tampón
Tiene que tener
Los tampones son anfolitos sintéticos como:

Aplicaciones

 Separación de
proteínas como la a1- antitripsina, la
determinación de clases de hemoglobina e inmunogloubulinas y el análisis de
alimentos.

Sobre una cortina líquida se añade la muestra de forma
continua y en sentido perpendicular al desplazamiento se le aplica un campo
eléctrico. Los componentes de la muestra se separan lateralmente por acción del
campo eléctrico. Al final, los componentes son recogidos de forma continua en
cada uno de los correspondientes orificios.
Aplicaciones: purificación de HDL. Separación de linfocitos
T  y B, enzima t-PA…
 
La electroforesis capilar es una técnica alternativa de la
electroforesis convencional que nos permite aumentar el potencial eléctrico con
lo que aumenta la velocidad. Para ello 
se realiza la electroforesis en un tubo capilar con un diámetro interno
inferior a 0,1 mm y una longitud de 50 cm a 1 m. 
El mecanismo de separación está basado en las relaciones
carga/masa de los analitos. La muestra se introduce por inyección de alto
voltaje o por inyección de presión.
Su utilidad está en la separación de
proteínas y péptidos entre otras sustancias.
Ofrece además mayor facilidad y velocidad que la
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

Elimina el problema de los disolventes

de la HPLC, la toxicidad de los mismos y su costo, pues emplea soluciones acuosas. Se pueden utilizar
detectores cuantitativos como los empleados en HPLC.
Otra ventaja es su automatización  
Como resultado se obtiene un electroferograma con
picos carácterísticos de cada compuesto separado.
Podemos diferenciar varios tipos
de electroforesis capilar:
Las electroforesis en gel más usadas son la de
poliacrilamida (PAGE) y la de agarosa.
En estas electroforesis el criterio para separar es el del
tamaño de las fracciones ya que se trabajan en condiciones en las que las
cargas son similares para todas las fracciones.
El gel de poliacrilamida 
se emplea en la determinación de proteínas y en fracciones de ADN de
pequeño tamaño.
El gel de agarosa se emplea para fracciones de ADN más
grande.
El gel de poliacrilamida se puede usar en condiciones no
desnaturalizantes, en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE)  o en gradiente de concentración.
Vamos a describir alguna de ellas:
La poliacrilamida es un soporte empleado frecuentemente en
electroforesis en gel, es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz
de ser preparado de forma rápida y reproducible. Forma, además, geles
transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no
iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante tiempo
prolongado. Además tiene la ventaja de que variando la concentración de
polímeros, se puede modificar de manera controlada el tamaño del poro.  El soporte es un polímero de la
acrilamida/bisacrilamida.
1.1PAGE en condiciones no desnaturalizantes
La modalidad más sencilla es en la que la muestra se carga
directamente en el gel en el cual se va a producir la separación, por lo tanto,
la concentración del gel es uniforme y hay un único tampón. La PAGE se
desarrolla en condiciones en las que no se altera la conformación nativa de las
proteínas separadas, por lo que finalizada la electroforesis, pueden realizarse
estudios de funcionalidad de dichas proteínas separadas (actividad enzimática,
capacidad de uníón de anticuerpos, uníón a receptores, etc.).
1.2 PAGE en condiciones desnaturalizantes
En presencia de algunos compuestos químicos, las proteínas
pierden su estructura nativa; tales compuestos, llamados agentes
desnaturalizantes, producen el desplegamiento de la proteína que queda, así,
sin la organización tridimensional carácterística de su funcionalidad
biológica. La más conocida es la PAGE-SDS:
PAGE-SDS
Permite
el cálculo de parámetros moleculares (al contrario que el resto de los tipos de
electroforesis), pues los complejos SDS-proteína se separan estrictamente según
su tamaño molecular. El SDS  (dodecil
sulfato de sodio) interacciona con las proteínas formando complejos de
carácterísticas comunes independientemente de las de cada proteína. También se utiliza con fragmentos pequeños de ADN.
La
agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar,
pero de composición homogénea), cuyas concentraciones (normalmente entre 0.5 a
2 % p/v) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 º C y
formar un gel, semisólido al enfriarse. Este gel está constituido por una
matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad
de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas, se usa usualmente para
separar moléculas grandes de  ADN de alrededor
20.000 nucleótidos.

 
 
El
uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de
concentración  de acrilamida +
bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamaño del
poro, pueden tener ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de
acrilamida. En un gel en gradiente la proteína migra hasta alcanzar una zona
donde el tamaño de poro impida cualquier avance. Una vez se alcanza el límite
del poro no se produce una migración apreciable aunque no se detiene
completamente.

Se emplean geles de agarosa al 1%, pero se altera
periódicamente la orientación del campo eléctrico aplicado, activando
alternativamente dos pares de electrodos.
 El frecuente cambio
de dirección del campo eléctrico consigue que las moléculas se desplieguen y
avancen a través de los poros en conformación extendida.
A mayor tamaño, se reorientan con más dificultad, por lo que
avanzan más despacio.