Análisis cromosómico de metafases completas

Se analizan como mínimo 20 metafases vistas con el objetivo de 100x. Se cuentan y se observan los cromosomas. Las 5 de mejor calidad se fotografían.

Metafases fotografiadas se someten a un análisis completo:

• Se compara cada cromosoma con su homólogo banda a banda.
• Así se detecta cualquier cambio en la estructura del cromosoma.
• En caso de mosaicismo se analizan como mínimo 30 metafases.

Ordenamiento y emparejamiento:

Se realiza en función de:

• Las características morfológicas.
• El patrón de bandas G.

Patrón de bandas G:

Son las más usadas en análisis cromosómico. Permiten la identificación inequívoca de todos los cromosomas. Especialmente importante para el grupo C. Facilita la detección y análisis de las alteraciones estructurales. El patrón estándar es de 350 – 400 bandas que corresponden a cromosomas metafásicos totalmente condensados.

Características morfológicas de los cromosomas humanos:

Criterios de ordenación:

• Tamaño: de mayor a menor.
• Posición del centrómero: a igual tamaño van primero los metacéntricos, luego los submetacéntricos y finalmente los acrocéntricos.
• Presencia de constricciones secundarias: el cariotipo humano se ordena en ocho grupos.

Grupos:

A: Constituido por los cromosomas 1, 2 y 3. 1 y 3 son metacéntricos y el 2 submetacéntrico.

B: 4 y 5 grandes y submetacéntricos.

C: Del 6 al 12 submetacéntricos medianos. A este grupo pertenece el X que se sitúa entre el 6 y el 7.

D: 13 al 15. Acrocéntricos grandes con constricción secundaria y satélite.

E: 16 al 18. Submetacéntrico pequeños.

F: 19 y 20. Metacéntricos pequeños.

G: 21 y 22. Acrocéntricos pequeños con constricción secundaria y satélite.

Sexuales: X submetacéntrico mediano, Y acrocéntricos pequeño como los del grupo G.

Cariotipo de alta resolución:

Es el que se obtiene a partir de cromosomas en profase tardía o prometafase. Al ser el grado de condensación menor se obtienen entre 550 y 850 bandas al realizar un bandeo G. Aumenta la sensibilidad del cariotipo a 5 Mb. Para realizarlo es necesario sincronizar el cultivo de linfocitos.

Objetivo de la citogenética:

Diagnóstico de enfermedades con base genética basándose, principalmente, en el cariotipo.

Cariotipo:

Conjunto de cromosomas de una especie, individuo o célula ordenados de acuerdo a su tamaño y morfología.

Especie:

El conjunto normal de cromosomas que caracteriza a una especie.

Individuo:

Cariotipo constitutivo. Es el de la mayor parte de las células de un organismo.

Célula:

El de una célula en concreto.

Para hacer un cariotipo es necesario:

• Poder ver los cromosomas con el M.O. por lo que tienen que estar condensados en la metafase.
• Para obtener metafases es necesario realizar un cultivo celular, sacrificarlo y realizar extensiones a partir de él.
• Para visualizar los cromosomas hay que teñir la extensión anterior.

Cariotipo estándar de sangre periférica:

Se obtiene a partir de una muestra de sangre periférica.

Fases:

Cultivo de linfocitos, obtención de extensiones cromosómicas en metafase, tinción de los cromosomas con técnicas de bandeo, análisis de los cromosomas teñidos.

Cultivo de linfocitos:

Componentes:

• Muestra: sangre venosa anticoagulada con heparina. No usar EDTA.
• Medio de cultivo: los más usados son: RPMI 1640, DMEM y HAM F10. Suplementos: suero bovino al 10 – 20%, L-glutamina y antibióticos (penicilina / estreptomicina).
• Recipiente: frasco Roux o tubos.
• Cultivo:
  • Siembra: se añade la muestra al medio de cultivo en proporción 1/5 a 1/10.
  • Adición de fitohemaglutininas: son lectinas de origen vegetal que provocan que los linfocitos T se desdiferencien a linfoblastos y estos comenzarán a proliferar. La dosis depende de su presentación comercial.
  • Incubación: a 37ºC y 5% de CO₂ durante 72 horas, si el cultivo está en tubos hay que ponerlos a una inclinación de 45º.
  • Detención de la mitosis en metafase: entre 90 minutos y dos horas antes de finalizar la incubación se añade al cultivo una o dos gotas de una solución stock de 10 µg/ml de colchicina como colcemid.

Obtención de extensiones en metafases:

1. Sacrificio del cultivo:
   1. Se traspasa el cultivo a un tubo Falcon cónico de 15ml.
   2. Centrifugar a 1500 rpm durante 5 – 10 minutos.
   3. Eliminar el sobrenadante dejando solo 0,5ml para resuspender el botón celular.
2. Choque hipotónico e incubación: las células se llenan de agua y se hinchan con lo que los cromosomas metafásicos se distribuyen por todo el citoplasma, separándose. Técnica:
   1. Añadir 5ml de KCl 0,075M y mezclar.
   2. Incubar a 37ºC o tra ambiente de 5 a 20 minutos según protocolo.
   3. Centrifugar a 1500 rpm durante 5 – 10 minutos.
   4. Eliminar el sobrenadante y dejar un botón celular.
3. Fijación y lavado:
   1. Fijador de Carnoy: metanol – ácido acético en proporción 3:1.
   2. Añadir 5ml de fijador al tubo con las células.
   3. Dejar reposar 5 minutos.
   4. Centrifugar a