Anàlisi de l'Hemoglobina: Tipus, Determinació i Patrons

Introducció a l'Hemoglobina (Hb)

L'hemoglobina (Hb) és una proteïna complexa que transporta l'oxigen. Està formada per quatre cadenes polipeptídiques i quatre grups hemo. Els principals tipus d'Hb en adults són:

• HbA (96-97%): α2β2
• HbA2 (2-3%): α2δ2
• HbF (<1%): α2γ2 (fetal, pot no detectar-se amb alguns mètodes)

Aquests tipus d'Hb es diferencien en les cadenes polipeptídiques que les formen. Qualsevol alteració en el tipus d'Hb o en els seus percentatges normals s'anomena hemoglobinopatia.

Tipus d'Hemoglobinopaties

• Hemoglobinopatia qualitativa: Presència d'una Hb diferent a les tres normals (4t o 5è tipus d'Hb en sang).
• Hemoglobinopatia quantitativa: Canvi en els percentatges de les tres Hb normals (sense aparició d'una altra Hb).

Una hemoglobinopatia qualitativa pot ser quantitativa, però una quantitativa no pot ser qualitativa.

Determinació de l'Hb Total (Mètode de la CianmetaHb)

1. Concentració d'Hb total: Es lisen els eritròcits mitjançant hemòlisi amb aigua destil·lada.
2. Mètode de la cianmetaHb: Es provoquen canvis químics en l'Hb per convertir-la en cianmetaHb, que absorbeix la llum a 540 nm. S'utilitza el reactiu de Drabkin amb la mostra de sang. Un espectrofotòmetre mesura l'absorbància, que augmenta amb la concentració d'Hb. La concentració d'Hb s'expressa en g/L. Els valors normals són 14-18 g/L en homes i 11-16 g/L en dones.
3. Valoració a l'espectrofotòmetre.
4. Càlcul matemàtic per obtenir la concentració d'Hb.

Determinació de les Fraccions d'Hb (Electroforesi)

L'electroforesi separa les molècules segons la seva càrrega elèctrica. L'Hb, com a proteïna, té càrrega elèctrica. Els diferents tipus d'Hb (HbA, HbA2, HbF) tenen aminoàcids diferents i, per tant, càrregues elèctriques diferents, cosa que permet la seva separació per electroforesi. El punt isoelèctric (PI) és el pH on la càrrega d'una proteïna és nul·la. Els PI de les Hb són: HbA (7,1), HbA2 (7,6) i HbF (7,3).

Passos de l'Electroforesi

1. Rentatge eritrocitari: Es renten els eritròcits en tres cicles per eliminar les proteïnes unides a la membrana. El sobrenedant es descarta.
2. Hemòlisi: Es provoca la hemòlisi del precipitat amb aigua o cloroform.
3. CianmetaHb: Es determina la concentració total d'Hb.
4. Dilució: Es dilueixen les mostres a la mateixa concentració d'Hb (per exemple, 5 g/L) i s'homogeneïtzen.
5. Electroforesi:
   • Acetat de cel·lulosa (pH 8,6): Mètode ràpid i econòmic. Les Hb es desplacen sobre el paper humit. Es tenyeixen per visualitzar-les. Separa les Hb segons la seva càrrega elèctrica.
   • Citrat d'agar: Separa les Hb segons la seva mida i càrrega elèctrica.
   • Isoelectroenfoc (gel de poliacrilamida): Utilitza els PI per separar les Hb. Un gradient de pH en vertical atura les Hb quan el pH coincideix amb el seu PI. Mètode car però amb millor resolució.
6. Coloració i decoloració: Es tenyeixen les bandes d'Hb amb vermell de Ponceau (acetat de cel·lulosa) o blau de Coomassie (gels). Es decolora l'excés de colorant.
7. Processament i quantificació: Es quantifica l'Hb mitjançant colorimetria (espectrofotòmetre) o densitometria.

Altres Mètodes

• Cromatografia d'intercanvi iònic: Separa les proteïnes segons la seva càrrega mitjançant una columna amb esferes amb grups iònics. S'utilitza NaCl per recuperar les proteïnes.
• Mètode de Betke (quantitatiu per a HbF): Es basa en la resistència de l'HbF a l'acció d'una base (NaOH), mentre que l'HbA i l'HbA2 es desnaturalitzen.
• Test de Kleihauer (qualitatiu per a HbF): Es basa en la resistència de l'HbF a un àcid (pH 3,3), mentre que l'HbA i l'HbA2 són sensibles.

Patró Electroforètic Normal

• HbA (96-97%): Banda més gran i amb càrrega negativa.
• HbA2 (2-3%): Banda prima.
• HbF (<1%): Banda fetal.

Variants d'Hemoglobina i Talassèmies

Descriu les següents hemoglobinopaties: HbD, HbC, HbE, Alfa-talassèmia (HbH), Beta-talassèmia, Persistència de l'HbF, Tret falciforme i Anèmia falciforme. S'expliquen les mutacions, els patrons electroforètics i les implicacions clíniques de cadascuna.