Amplificación de secuencias de ADN: Clonación y Vectores

Amplificación in vivo de secuencias de ADN - OBJETIVO: disponer de una cantidad apreciable de mi secuencia de ADN de interés. REPLICACIÓN DEL VECTOR DENTRO DE LA CÉLULA + MULTIPLICACIÓN DE CÉLULAS EN CULTIVO GRAN CANTIDAD DE ADN RECOMBINANTE.

Pasos del proceso de clonación

Ambas son moléculas de ADN!! - Inserción del fragmento de ADN que se quiere amplificar en una molécula portadora o vector. Introducción del vector recombinante en una célula viva hospedadora. Solo las células con el vector + fragmento correcto se identifican y seleccionan. Selección y multiplicación en cultivo de las células que portan el ADN recombinante. Recuperación del fragmento amplificado (opcional).

Ventajas

✓ Cantidades ilimitadas de la secuencia. ✓ Clonar secuencias de ADN de gran tamaño. ✓ Permite la creación de librerías genómicas. ✓ Posibilita la expresión de genes.

Componentes de clonación

- Vectores de clonación. - Insertos. - Células hospedadoras. Procariotas: Bacterias. Eucariotas: Levaduras, Animales, Vegetales.

Tipos de vectores

1. PLÁSMIDOS. 2. BACTERIOFAGOS. 3. COSMIDOS. 4. Fagémidos. 5. Cromosomas artificiales. 6. Vectores lanzadera.

Células hospedadoras

Son aquellas que amplifican, mediante replicación, el vector de clonación que les ha sido previamente introducido.

Fases del proceso de clonación

1) Creación de un vector recombinante: - Vector recombinante = Vector + inserto de ADN extraño. - Amplificación inserto – PCR. - Creación extremos cohesivos – Digestión con ENZIMAS DE RESTRICCIÓN. - Ligación extremos cohesivos vector e inserto – LIGASA.

Vectores

- Vector circular con diana de restricción única. - Vector circular con dos dianas de restricción. - Vector lineal con una diana de restricción única. - Vector lineal con dos dianas de restricción.

Métodos para introducir un vector recombinante en una célula hospedadora

#Transformación bacteriana: consiste en la captación por parte de una bacteria de moléculas de ADN desnudas presentes en el medio. #Transfección no mediada por virus. #Transducción. #Electroporación.

Identificación de clones recombinantes

Una vez terminado el proceso de introducción del vector, se obtiene una mezcla con tres tipos de células: 1. Células no transformadas. 2. Células transformadas que portan el vector recombinante. 3. Células transformadas que portan un vector no recombinante. 4. Células transformadas que portan alguna molécula de ADN no deseada.

Selección e identificación

Los clones deseados que porten el vector recombinante específico. Condicionado por marcadores genéticos que porta el vector: - Genes de resistencia a antibióticos. - Enzimas que producen reacciones coloreadas. - Proteínas fluorescentes. - Genes letales.

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