ADN recombinante: usos, vectores y enzimas clave en biotecnología

ADN recombinante: definición y usos

ADN recombinante: molécula de ADN artificial formada de manera liberada in vitro por la unión de secuencias de ADN provenientes de dos organismos diferentes que normalmente no se encuentran juntas. Al introducirse en un organismo se produce una modificación genética que permite la adición de un nuevo ADN al organismo.

Usos

• Producir proteínas en el tratamiento de enfermedades genéticas.
• Vacunas.
• Fines económicos.

Vectores

Vectores: moléculas de ADN transportadoras.

Características de los vectores

1. Poder replicarse independientemente junto con el segmento de ADN que transporta.
2. Contener algunos sitios de corte para enzimas de restricción presentes solo una vez en el vector.
3. Tener algún marcador de selección para poder distinguir las células huésped que transportan el vector de las que no lo contienen.
4. El vector de la célula huésped debe ser fácil de recuperar.

Tres tipos de vectores: plásmidos, bacteriófagos y cosmidos.

Plásmidos

Plásmidos: son moléculas de ADN de doble cadena extracromosómicas de origen natural que se replican autónomamente en las células bacterianas.

Bacteriófagos λ (lambda)

Bacteriófagos lambda: lambda es un bacteriófago muy utilizado en experimentos de ADN recombinante. El tercio central de su cromosoma es prescindible y puede reemplazarse por ADN exógeno sin afectar la capacidad del fago para infectar células y formar calvas en el césped bacteriano.

Procedimiento

Se extrae el ADN de una preparación de fago lambda y se elimina el grupo central de genes por tratamiento con una enzima de restricción. El ADN a clonar se corta con la misma enzima y se liga entre los brazos del cromosoma de lambda. Luego, se empaqueta el cromosoma recombinante dentro de las proteínas del fago para formar un virus recombinante. Este virus puede infectar células bacterianas y replicar su cromosoma, incluido el inserto de ADN. Las placas de lisis correspondientes a células infectadas aparecen sobre un césped bacteriano.

Cosmidos

Cosmidos: son vectores híbridos construidos utilizando partes del cromosoma del fago lambda y de ADN plasmídico. Los cosmidos pueden transportar insertos de ADN mucho más grandes que los que lambda puede llevar; se emplean para investigar la expresión genética.

BAC

BAC (cromosomas artificiales bacterianos): se utilizan para cartografiar y analizar genomas eucariotas complejos; están basados en el factor F de bacterias.

Factor F

Factor F: es un plásmido que se replica independientemente y que está implicado en la transferencia de información genética; pueden transportar fragmentos del cromosoma bacteriano de hasta 1 Mb.

YACs

YACs (cromosomas artificiales de levadura): son grandes pedazos de ADN que contienen los componentes necesarios que le permiten propagarse junto con los otros cromosomas de la célula de levadura. Inconveniente: suelen ser inestables.

Enzimas utilizadas

• Endonucleasa de restricción tipo II: romper ADN por secuencias específicas.
• ADN ligasa: unir dos moléculas o fragmentos.
• ADN polimerasa I: rellenar los huecos de ADN dúplex mediante adición escalonada de nucleótidos en el extremo 3′.
• Transcriptasa inversa: hacer una copia de ADN a partir de una molécula de ARN.
• Polinucleótido quinasa: añadir un grupo fosfato al grupo OH para permitir la ligación.
• Transferasa terminal: añadir colas homopoliméricas al grupo OH.
• Exonucleasa III: eliminar residuos nucleotídicos del extremo 3′.
• Exonucleasa del bacteriófago lambda: eliminar nucleótidos del extremo 5′.
• Fosfatasa alcalina: eliminar fosfatos terminales de extremos 5′ o 3′ o ambos.