ADN, Plásmidos, ARN y Electroforesis: Conceptos y técnicas fundamentales en biología molecular

I.1 ADN

El ácido desoxirribonucleico (ADN) es una molécula que consiste de dos largas cadenas de polinucleótidos compuesta de cuatro tipos de nucleótidos. Ambas cadenas se mantienen unidas mediante puentes de hidrógeno formados entre los nucleótidos de cada hebra. Los nucleótidos están compuestos de un azúcar de cinco carbonos el cual está unido a grupos fosfato y a una base nitrogenada. La estructura 3D que adopta el ADN de doble hebra es de una doble hélice que surge de las características químicas y estructurales de sus dos cadenas polinucleotídicas. Las dos cadenas se mantienen unidas por enlaces de hidrógeno entre las bases de las diferentes hebras, todas las bases están ubicadas al interior de la doble hélice y el esqueleto azúcar-fosfato va por fuera.

I.2 PLÁSMIDOS

Un plásmido es un ADN extracromosomal que se caracteriza por ser circular y que puede autoreplicarse en una célula bacteriana en forma independiente a la replicación del cromosoma, pues posee su propio origen de replicación. Pueden poseer genes que codifican para distintas proteínas, como aquellas que le otorgan la resistencia a los antibióticos o a sustancias tóxicas, genes necesarios para la patogenicidad, enzimas degradativas, para realizar la conjugación, para su propia regulación, etc. Se han encontrado plásmidos en bacterias ambientales a los que no se les ha podido determinar una función o aporte a la genética de la célula que los porta, estos son llamados plásmidos crípticos. El número de copias de plásmidos puede ser alto (500 a 700), intermedio (50 a 100) o bajo (15 a 20). Los plásmidos también pueden ser clasificados según los genes que poseen, como los plásmidos R que codifican para la resistencia a los antibióticos. Por ser pequeños en tamaño en comparación con el cromosoma, y de fácil manejo para ser purificados y modificados genéticamente, son candidatos ideales para su uso como vectores de genes de interés en estudio o para diversas aplicaciones.

I.3 ARN

El ácido ribonucleico (ARN) es una molécula lineal de hebra sencilla encargada de transferir la información genética del ADN para que se puedan fabricar las proteínas. El ARN es muy versátil, sirve tanto para intermediar en la expresión génica como para actuar de catalizador en la síntesis proteica.

ARN mensajero (ARNm)

ARN lineal, que contiene la información, copiada del ADN, para sintetizar una proteína. Se forma en el núcleo celular, a partir de una secuencia de ADN. Sale del núcleo y se asocia a ribosomas, donde se construye la proteína. A cada tres nucleótidos (codón) corresponde un aminoácido distinto.

ARN ribosómico (ARNr)

El ARN ribosómico, o ribosomal, unido a proteínas de carácter básico, forma los ribosomas. Los ribosomas son las estructuras celulares donde se ensamblan aminoácidos para formar proteínas, a partir de la información que transmite el ARN mensajero. Hay dos tipos de ribosomas, el que se encuentra en células procariotas y en el interior de mitocondrias y cloroplastos, y el que se encuentra en el hialoplasma o en el retículo endoplásmico de células eucariotas.

ARN transferente (ARNt)

El ARN transferente o soluble es un ARN no lineal. En él se pueden observar tramos de doble hélice intracatenaria, es decir, entre las bases que son complementarias, dentro de la misma cadena. Esta estructura se estabiliza mediante puentes de hidrógeno. La función del ARNt consiste en llevar un aminoácido específico al ribosoma. En él se une a la secuencia complementaria del ARNm, mediante el anticodón.

I.4 Electroforesis

Los ácidos nucleicos, moléculas de importancia en biología, poseen grupos ionizables y en solución pueden estar cargados eléctricamente como aniones (-) o como cationes (+). Si estas moléculas se someten a la fuerza de un campo eléctrico, se desplazarán los cationes hacia el polo negativo (cátodo) y los aniones hacia el positivo (ánodo). A la vez, moléculas con carga similar, pero con diferencia en tamaño y forma, pueden separarse al migrar a velocidades diferentes debido a las fuerzas de retardo que ofrece el medio circundante. La localización del ADN dentro del gel puede determinarse directamente mediante tinciones con bajas concentraciones de colorantes fluorescentes capaces de intercalarse en el ADN, como por ejemplo el bromuro de etidio.

Para la separación de ácidos nucleicos y de proteínas, las técnicas electroforéticas más versátiles son las que se realizan en geles de agarosa y de poliacrilamida. Estos geles están constituidos por una compleja red de cadenas poliméricas entrelazadas al azar, formando un enmallado que sirve de tamiz molecular, con tamaño de poro que varía con el tipo de polímero, su concentración y la forma de preparación. El tamaño de poro es más pequeño y más controlable en geles de poliacrilamida, en los cuales se pueden separar de manera eficiente moléculas pequeñas como proteínas, ARN y fragmentos pequeños de ADN, mientras que, para la separación de moléculas de ADN de tamaños superiores al centenar de pares de bases, es necesario el uso de geles de agarosa. Los geles de agarosa suelen prepararse con concentraciones desde el 0.3 al 2% en soluciones buffer con fuerza iónica comprendida entre 0.05 y 0.10 mols.dm-3, suficiente para que se conduzca efectivamente la corriente sin que se produzca exceso de calor.

Las muestras de ADN se preparan mezclándolas con una solución más densa que el buffer. Para aumentar la densidad se usa el glicerol, el ficoll, la sacarosa, la glucosa. Para visualizar la colocación de las muestras y la evolución de la electroforesis se usan colorantes como el azul de bromofenol y el xilencianol. Para la mayoría de las electroforesis, la diferencia de potencial usada es de 10 V/cm, pero para la separación de moléculas grandes es mejor usar bajos voltajes 1-2 V/cm.

Las bandas de ADN se visualizan por tinción con un colorante fluorescente que se intercala en el ADN. Para este fin se utiliza una solución de bromuro de etidio de 0.5 – 1 μg/mL durante 15 min; también se puede incorporar el colorante en la cámara de electroforesis o en el momento de preparar el gel. El gel teñido se observa sobre un transiluminador de luz U.V. y se registra fotográficamente para el análisis de resultados; de esta forma se pueden detectar desde 1 a 50 ng de ADN, lo cual depende del grosor del gel y las dimensiones de la celdilla. Las moléculas de ADN se separan en bandas cuya posición en el gel está determinada por su movilidad electroforética, que a su vez depende del tamaño y forma de las moléculas; así, moléculas pequeñas o compactas se mueven más rápido a través del gel que moléculas grandes y relajadas.

La mayoría de los procedimientos de análisis electroforético del ADN se llevan a cabo en geles de agarosa horizontales, dadas las siguientes ventajas:

• La preparación de los geles es sencilla y se facilita la manipulación y tinción.
• Los equipos y elementos para la elaboración del gel y para su utilización no son costosos y son fáciles de construir y montar.
• La agarosa puede prepararse a bajas concentraciones porque el apoyo del gel recae totalmente sobre la bandeja de gelificación.
• Pueden prepararse geles de una amplia variedad de tamaños.