Àcids Nucleics i Enzims: Estructura, Replicació i Purificació

Àcids Nucleics i Enzims Associats

Funció dels Àcids Nucleics

Els àcids nucleics (ADN i ARN) són macromolècules que emmagatzemen, transmeten i expressen la informació genètica.

• ADN: Emmagatzma la informació hereditària i controla la transmissió a la descendència.
• ARN: S'encarrega de l'expressió de la informació mitjançant la síntesi de proteïnes.

Estructura dels Nuclòtids

Els nuclòtids són les unitats bàsiques dels àcids nucleics.

Components:

• Base nitrogenada: Adenina, guanina, citosina, timina i uracil.
• Pentosa: D-ribosa (ARN) i D-2-desoxiribosa (ADN).
• Àcid fosfòric: Dona càrrega negativa als àcids nucleics.

Enzims Associats

Enzims específics fan possible la transmissió de la informació genètica des de l'ADN fins a la seva expressió final com a proteïnes.

Nuclòsids i Nuclòtids

• Nuclòsids: Són compostos formats per la unió d'una base nitrogenada i una pentosa mitjançant un enllaç N-glicosídic. Aquest enllaç es fa entre el carboni C1' de la pentosa i un nitrogen de la base.
• Nuclòtids: Un nuclòtid és un nuclòsid unit a una molècula d'àcid fosfòric mitjançant un enllaç èster entre el carboni C5' de la pentosa i l'àcid fosfòric.

Enllaços entre Nuclòtids

Els nuclòtids es vinculen entre sí pel grup fosfat mitjançant un enllaç fosfodièster (C5' a C3'). Si la cadena és curta, es parla d'oligonuclòtids.

Extrems de la Cadena de Nuclòtids

Tota cadena té dos extrems:

• Extrem 5’ (C5' del primer nuclòtid)
• Extrem 3’ (C3' de l'últim nuclòtid)

Propietats Fisicoquímiques dels Àcids Nucleics

Són fortament àcids per la presència dels grups fosfat. Tenen elevada viscositat i un pic d'absorció de llum ultraviolada a 260 nm.

Desnaturalització i Renaturalització

L'ADN es pot desnaturalitzar (separar les cadenes) mitjançant calor o elevant el pH. Quan es renaturalitza (es recupera la forma doble hèlix) es fa baixant la temperatura o reduint el pH.

Hibridació

Les dues cadenes d'àcids nucleics amb bases complementàries es poden unir mitjançant ponts d'hidrogen en un procés anomenat hibridació.

L’ADN

Funció de l'ADN

L’ADN emmagatzma la informació genètica d’un individu, la transmet als descendents i dirigix la síntesi de proteïnes. Es troba principalment al nucli, amb petites quantitats a mitocondris i cloroplasts (en organismes eucariots).

Estructura de l'ADN

L’ADN és un polímer format per desoxiribonuclòtids (adenina, guanina, citosina i timina) i s’organitza en quatre nivells estructurals: primària, secundària, terciària i quaternària.

Estructura Primària

• Mida: Els cromosomes contenen milions de parells de bases.
• Composició: La proporció de desoxiribonuclòtids varia entre espècies però és constant dins de la mateixa espècie.
• Seqüència de bases nitrogenades: La seqüència de bases té direcció 5' → 3' i és l'estructura primària de l'ADN.

Estructura Secundària

Complementarietat: L'adenina es combina amb la timina (A=T) i la citosina amb la guanina (C≡G) mitjançant ponts d'hidrogen. Diàmetre de la doble hèlix: 2 nm (20 Å), amb 10 nuclòtids per gir complet (3,4 nm).

Estructura Terciària de l'ADN

Només es troba a l'ADN del nucli de cèl·lules eucariots. L'ADN es combina amb proteïnes bàsiques (histones) per formar una unitat estructural anomenada nucleosoma, que té forma de "collar de perles". Aquest conjunt es combina per formar una fibra de cromatina. La fibra de cromatina es compacta en una unitat anomenada solenoide, creant una configuració tridimensional.

Estructura Quaternària

Durant la divisió cel·lular mitòtica, les fibres de cromatina s'superenrotllen per formar els cromosomes metafàsics. El nombre de cromosomes és característic de cada espècie.

Altres Organitzacions de l'ADN

• ADN procariota: Els procariots tenen un cromosoma bacterià únic (bicatenari i circular), amb petits fragments anomenats plasmidis.
• ADN mitocondrial: L’ADNmt és una molècula circular i bicatenària, que codifica 37 gens. Es replica independentment de l'ADN nuclear.
• ADN de cloroplasts: L'ADN dels cloroplasts en les cèl·lules vegetals és també bicatenari i circular.
• ADNc: ADN copiat de l'ARN mitjançant retrotranscriptasa en un procés de laboratori, utilitzat per estudiar l'expressió gènica.
• ADN viral: Pot ser monocatenari o bicatenari, i la seva forma pot ser lineal o circular.

L'ARN

Funció

L'ARN controla la síntesi de proteïnes a partir de la informació continguda a l'ADN.

Estructura Bàsica

És una cadena monocatenària de ribonucleòtids formats per ribosa, adenina, guanina, citosina i uracil (sense timina). Pot plegar-se en regions de doble hèlix (forcuts) amb bucles.

Tipus Principals d'ARN

• ARN missatger (ARNm): És la còpia de l'ADN que porta la informació per sintetitzar proteïnes. Cada codó (triplet de bases) codifica un aminoàcid. En eucariots, cada molècula d'ARNm codifica normalment per a una única proteïna (monocistrònic).
• ARN ribosòmic (ARNr): S'associa amb proteïnes per formar els ribosomes, que són essencials per a la síntesi de proteïnes. Es classifica segons el seu coeficient de sedimentació (procariots: 5S, 16S, 23S; eucariots: 5S, 5.8S, 18S, 28S). Té una estructura secundària complexa amb múltiples regions complementàries, forcuts i bucles.
• ARN de transferència (ARNt): Transporta els aminoàcids fins als ribosomes per incorporar-los a la cadena proteica. Té una estructura secundària en forma de fulla de trèvol amb quatre forcuts i tres bucles. L'extrem 3' sempre conté la seqüència 5’-CCA-3’, que és el lloc d'unió de l'aminoàcid. Disposa de regions funcionals clau: el braç D (unió de l'enzim aminoacil-ARNt-sintetasa), el braç T (unió al ribosoma) i el braç anticodó (complementari al codó de l'ARNm).

ARN amb Funcions Reguladores

• ARN regulador (ARNsi, ARNmi): Molècules petites que controlen l'expressió gènica blocant la traducció de l'ARNm o promovent la seva degradació.
• Altres tipus d'ARN:
  • ARN heterogeni nuclear (ARNn): Precursor de l'ARNm, que es madura al nucli.
  • ARN petit nuclear (ARNsn): Intervé en la maduració de l'ARNm, formant ribonucleoproteïnes al nucli.
  • ARN petit nucleolar (ARNsno): Present al nuclèol i precursor dels ARNr (excepte el 5S, que es forma per tall).

Replicació de l'ADN

Objectiu

Duplicar una molècula d'ADN per obtenir dues cadenes fiables idèntiques que mantenen la mateixa seqüència de bases.

Característiques Clau

• Semiconservativa: Cada nova molècula conté una cadena original i una nova.
• Orígens de replicació:
  • Procariots: Un únic origen.
  • Eucariots: Diversos orígens, amb replicació simultània en diversos punts.
• Bidireccional i seqüencial: A partir de l'origen, les dues cadenes es separen i la síntesi es produeix en ambdues direccions, formant dues forcuts de replicació.
• Síntesi de cadenes:
  • Cadena líder (avançada): Es sintetitza de manera contínua.
  • Cadena retardada: Es sintetitza de manera discontinua en fragments (fragments d'Okazaki) degut a la direccionalitat 5' → 3'.

Fases de Replicació

1. Fase d'Iniciació (Procariots)

• Reconeixement de l'origen: Proteïnes específiques s'uneixen a l'origen de replicació.
• Obertura de l'ADN: Les helicases separen les dues cadenes, creant una bombolja de replicació.
• Estabilització: Les proteïnes SSB s'unixen a les cadenes separades per evitar que es re-aniguen, mentre que les topoisomerases/girases relaxen la tensió.
• Forcuts de replicació: Els extrems de la bombolja, on s'iniciarà la síntesi de noves cadenes.

2. Fase d'Elongació (Procariots)

• Inici de la síntesi: La primasa sintetitza encebadors (primers) en direcció 5' → 3'. En la cadena líder es necessita un únic encebador, mentre que en la cadena retardada es generen múltiples encebadors per formar fragments d'Okazaki.
• Elongació: La DNA-polimerasa III afegeix desoxinuclòtids al 3' lliure, sintetitzant la nova cadena. En la cadena retardada, la síntesi és discontinua (fragments d'Okazaki).
• Remplaçament dels encebadors: La DNA-polimerasa I elimina els encebadors (mitjançant activitat exonucleasa) i els substitueix per ADN.
• Unió dels fragments: La ligasa unix els fragments d'Okazaki, donant continuïtat a la cadena retardada.

Correcció d'Errors

ADN-polimerasa I i III: L'activitat exonucleasa de les DNA-polimerases corregix errors en la incorporació de bases.

Pacularitats en Eucariots

• Múltiples orígens de replicació: La replicació s'inicia simultàniament en diversos punts de cada cromosoma.
• Diversitat d'enzims: Hi ha cinc tipus de DNA-polimerases amb funcions específiques (elongació, eliminació d'encebadors, correcció d'errors).
• Replicació de l'ADN associat a histones: Durant la replicació, els nucleosomes es reorganitzen i es duplica la informació associada a les histones.

Transcripció de l'ADN a ARN

La transcripció és el procés per sintetitzar una molècula d'ARN utilitzant una cadena d'ADN com a motlle.

Enzims Clau

Requereix l’ARN-polimerasa dependent d’ADN (transcriptasa).

• Procariots: Una sola ARN-polimerasa.
• Eucariots:
  • ARN-polimerasa I: Es transcriu l’ARNr.
  • ARN-polimerasa II: Es transcriu l’ARNm.
  • ARN-polimerasa III: Es transcriu l’ARNt i la subunitat 5S de l’ARNr.

Fases de la Transcripció

• Iniciació: L’ARN-polimerasa reconeix el promotor (una regió amb una seqüència específica) i s'hi unix. Les dues cadenes de l'ADN se separen i comença la incorporació de nuclòtids per formar l'ARN.
• Elongació: L’ARN-polimerasa afegeix ribonucleòtids de manera seqüencial, creixent l’ARN en direcció 5' → 3'.
• Terminació: La síntesi d’ARN s’atura quan l’ARN-polimerasa arriba a una seqüència de terminació. L’ARN es desenganxa de l'ADN i l'enzim es separa, permetent que l'ADN recuperi la seva estructura de doble hèlix.

Maduració de l'ARN

• Procariots: Els transcrits primaris (precursors d'ARNt i ARNr) es tallen per obtenir les molècules madures. L'ARNm no requereix modificacions posteriors.
• Eucariots: L'ARN heterogeni nuclear (ARNn) o pre-ARNm es processa per obtenir l’ARNm madur mitjançant tres passos:
  1. a) Caputxa al 5': S'afegeix una guanina metilada per protegir l'ARN.
  2. b) Cua de poli-A al 3': S'afegeixen diverses adenines (al voltant de 200 en humans) per facilitar l'exportació al citoplasma.
  3. c) Splicing: Es tallen els introns i s’empalmen els exons per formar l’ARNm funcional.

Traducció de l'ARNm

Objectiu i Conceptes Bàsics

La traducció converteix la informació de l'ARNm en una proteïna. El codi genètic és el diccionari que tradueix cada triplet de bases (codó) en un aminoàcid.

Característiques

• Universal: El codi genètic és el mateix per a tots els éssers vius.
• No ambigu: Cada codó codifica un únic aminoàcid.
• Degenerat: Diversos codons poden codificar el mateix aminoàcid.
• Continu i no solapat: Els codons es llegeixen seqüencialment sense solapaments ni espais.

Components Essencials

• ARNm: Porta la informació.
• Ribosomes: Constituïts de dues subunitats; la menor s'unix a l'ARNm i la major té els llocs P i A per a l'ARNt.
• ARNt: Transporten els aminoàcids i tenen anticodons complementaris als codons de l'ARNm.
• Enzims: Com l'aminoacil-ARNt-sintetasa (activació dels aminoàcids).

Fases del Procés de Traducció

• Activació: Cada aminoàcid s'unix al seu ARNt específic gràcies a l'enzim aminoacil-ARNt-sintetasa.
• Iniciació: La subunitat menor del ribosoma s'unix a l'ARNm, localitzant el codó d'inici AUG (metionina). Es forma una interacció entre el codó AUG i l'anticodó corresponent de l'ARNt-Met. La subunitat major s'incorpora, col·locant l'ARNt amb metionina al lloc P.
• Elongació: Un nou aminoacil-ARNt entra al lloc A (amb anticodó complementari al següent codó). L'enzim pèptidiltransferase catalitza la formació d'un enllaç peptídic entre l'aminoàcid del lloc P i el del lloc A. El ribosoma es desplaça (translocació) en direcció 5' → 3', movent l'ARNt del lloc A al lloc P i alliberant el tRNA buit del lloc P. Aquest cicle es repetix per cada codó llegit.
• Terminació: Quan el ribosoma troba un codó de terminació (UAA, UAG o UGA), no hi ha ARNt corresponent. Els factors d'alliberament reconeixen el codó de terminació, provoquen la hidròlisi del enllaç entre el polipèptid i l'ARNt, i alliberen la proteïna. Finalment, es desmunta el complex ribosòmic (separació de subunitats, ARNm i ARNt).

Extracció i Purificació d'Àcids Nucleics

Fase 1: Pretractament de les Mostres Biològiques

L'objectiu del pretractament és obtenir una suspensió cel·lular per a l'extracció d'àcids nucleics. Els pretractaments habituals inclouen:

Sang

• Purificació: s'extreuen àcids nucleics principalment dels leucòcits (glòbuls blancs).
• Eliminació de l'hemoglobina: A través de la lisi dels hematies (glòbuls vermells) mitjançant solucions de lisi (RBC).
• Conservació: Es recomana realitzar l'extracció dins de les 24 hores posteriors a la mostra per evitar degradació de l'ADN. Si es conserva a 4°C, la mostra pot durar fins a cinc dies.
• Procés de lisi d'hematies: Lisi dels hematies amb una solució de lisi en una proporció de 1:3 (sang:solució). Centrifugació: separar els leucòcits (aïllant el sediment) dels glòbuls vermells, eliminant el sobrenedant.
• Obtenció de Cèl·lules Mononuclears (per exemple, limfòcits): Mètode mitjançant centrifugació en gradient de densitat (Ficoll) per aïllar limfòcits i monòcits de la sang perifèrica.

Cultius Cel·lulars

Permeten obtenir cèl·lules in vitro mitjançant sembrats controlats en medis adequats.

• A. Cultius en suspensió: Recollir les cèl·lules en un tub. Eliminar el medi de cultiu per centrifugació. Rentar les cèl·lules amb tampó o sèrum fisiològic.
• B. Cultius en monocapa (cèl·lules adherits al flascó):
  • B1. Continuar al mateix flascó: retirar el medi de cultiu. Rentar la monocapa amb tampó. Iniciar l'extracció d'àcids nucleics al mateix flascó.
  • B2. Passar la monocapa a un tub: Desenganxar les cèl·lules mitjançant raspador o tripsina (0,10-0,25%). Recollir les cèl·lules. Eliminar la tripsina rentant les cèl·lules.

Teixits Animals o Vegetals

Pretractament: Homogenització per alliberar cèl·lules. Quantitats: teixits animals: 10-25 mg per obtenir 10-40 μg d'ADN. teixits vegetals: quantitats lleugerament majors per a un rendiment similar.

• A. Homogenització mecànica: Trossejar el teixit, triturar amb agents abrasius i agitació, o manual amb morter congelant amb nitrogen líquid.
• B. Homogenització química: Afegir proteases i detergents per disregar les cèl·lules. Incubar a 37-56°C durant 12-24 hores.

Teixits Fixats en Formol i Inclosos en Parafina (FFPE)

La qualitat dels àcids nucleics recuperats és inferior a la dels teixits frescos. Requereix desparafinació amb xilol, etanols amb concentracions decreixents i aigua destil·lada.

Altres Mostres

• Cultius de bacteris i llevats: Centrifugar, ressuspendre en tampó, o recollir colònies aïllades sobre medi sòlid.
• Cèl·lules de la mucosa oral: Raspat amb torunda i immersió en solució conservant o saliva directa.
• Esput: Fluïdificació amb agent mucolític i descontaminació amb hidròxid sòdic.

Fase 2: Extracció d'Àcids Nucleics

Implica dos processos principals: lisi cel·lular i inactivació de nucleases.

• Solució de lisi: Components com detergents, EDTA, proteases (proteinasa K) i agents caotròpics.
• Tractaments addicionals: Enzimàtic (lisozim, liticasa), mecànic (ebullició, sonicació) o químic (CTAB).
• Consideracions: Per purificar exclusivament ADN, s'ha d'eliminar l'ARN amb ARNasa A.

Fase 3: Purificació dels Àcids Nucleics

• 3.1 Purificació amb solvents orgànics: Mescla de fenol, cloroform i alcohol isoamílic. Separació en fase aquosa (superior) i orgànica (inferior), seguida de precipitació amb isopropanol/etanol.
• 3.2 Precipitació amb sals (Salting Out): Precipitació de proteïnes en presència de concentracions altes de sals, recuperant l'ADN del sobrenedant.
• 3.3 Cromatografia d'intercanvi iònic: Unió reversible d'ions de solució a grups carregats en una fase estacionària.
• 3.4 Cromatografia d'adsorció: Adsorció dels àcids nucleics al vidre o la sílice en presència de sals caotròpiques.
• 3.5 Purificació amb esferes magnètiques: Unió a microesferes magnètiques retingudes per un imant.
• 3.6 Ultrafiltració: Separació per grandària mitjançant membranes amb porus específics.
• 3.7 Purificació de plasmidis: Lisi alcalina basada en la desnaturalització i posterior renaturalització diferencial.
• 3.8 Consideracions per a l'ARN: Altament sensible a les ribonucleases; cal treballar en condicions d'esterilitat i amb inhibidors específics com el DPC.
• 3.9 Automatització: Ús de robots, partícules magnètiques i columnes de sílice automatitzades.

Qualitat dels Àcids Nucleics Purificats

La qualitat es determina per dos factors clau:

• a) Integritat: Determina si conserven la seva mida original. Es mesura per electroforesi en gel d'agarosa.
• b) Puresa: Mesura de l'absència de contaminants (proteïnes, sals). Es calcula amb ràtios d'absorbància:
  • Cocient A260/A280 (Ideal: 1,7 - 2,0 per a ADN).
  • Cocient A260/A230 per a contaminants menors.
• c) Concentració: Mesurada per absorbància a 260 nm on 1 unitat equival a 50 ng/μl d'ADN drec.