Western Blot: Técnica de Análisis de Proteínas

Western Blot

Introducción

El Western blot es una técnica analítica que combina tres métodos para identificar proteínas específicas en una muestra compleja. Estos métodos son:

1. Separación de proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida.
2. Transferencia de las proteínas separadas a una membrana inmovilizante (electrotransferencia o electroblotting).
3. Identificación de proteínas mediante enzimoinmunoensayo con anticuerpos específicos.

Pasos del Western Blot

El proceso de Western blot se lleva a cabo en seis pasos principales:

1. Solubilización del Antígeno (Ag)

El primer paso implica la ruptura del antígeno en sus componentes polipeptídicos, manteniendo los epítopes antigénicos intactos y activos. Esto asegura una distribución uniforme de las cargas, permitiendo que los péptidos migren en función de su peso molecular durante la electroforesis.

2. Preparación del Gel de Poliacrilamida

Se prepara un gel de poliacrilamida utilizando acrilamida y bisacrilamida. La concentración del gel se ajusta según el tamaño de las proteínas que se desean separar.

3. Separación Electroforética

Se cargan las muestras de proteínas en los pocillos del gel y se aplica un campo eléctrico. Las proteínas migran a través del gel en función de su tamaño y carga, separándose en bandas distintas.

4. Electrotransferencia

Las proteínas separadas en el gel se transfieren a una membrana de nitrocelulosa mediante la aplicación de una corriente eléctrica. Esto permite un mejor acceso de los anticuerpos a las proteínas durante la detección.

El proceso de electrotransferencia implica:

• Equilibrar el gel en un tampón durante 30 minutos.
• Colocar el gel y la membrana en una cubeta con tampón y aplicar corriente.
• Incorporar un control de transferencia para verificar la eficiencia del proceso.
• Aplicar un voltaje de 1 a 1000 V con refrigeración para evitar el sobrecalentamiento.

5. Bloqueo

Se bloquean los sitios de unión inespecíficos en la membrana con una solución de proteína, como albúmina de suero bovino (BSA), para evitar la unión no específica de los anticuerpos en pasos posteriores.

6. Detección

Se utiliza un enzimoinmunoensayo o radioinmunoensayo para detectar las proteínas de interés. Se incuba la membrana con anticuerpos específicos contra el antígeno diana, seguidos de un anticuerpo secundario marcado con una enzima o un isótopo radiactivo. La enzima cataliza una reacción que produce un producto detectable, como un cambio de color o emisión de luz, revelando la ubicación de las proteínas diana en la membrana.

Aplicaciones del Western Blot

El Western blot es una técnica ampliamente utilizada en investigación y diagnóstico para:

• Identificar la presencia y cantidad de una proteína específica en una muestra.
• Estudiar la expresión génica.
• Diagnosticar enfermedades infecciosas y autoinmunes.
• Monitorear la respuesta al tratamiento.