Ventajas y desventajas de la PCR en la amplificación de ADN

Ventajas y desventajas de la PCR

Ventajas pcr • La amplificación es más rápida que la clonación en vectores • Se pueden detectar secuencias concretas más rápido y con menor cantidad de muestra. Inconvenientes • Es una técnica muy sensible donde la contaminación (microorganismo, aerosoles, células, etc) pueden interferir en la prueba

La reacción en cadena de la polimerasa

-La reacción en cadena de la polimerasa o PCR (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de amplificación exponencial in vitro que permite obtener millones de copias iguales de un fragmento concreto de ADN Esta técnica está basada en la función de las proteínas polimerasas, que duplican el ADN durante la división celular

-La PCR (Polymerase Chain Reaction), es un proceso enzimático muy sensible y específico que está catalizado por una ADN polimerasa y se basa en la replicación del ADN

Ciclo de la PCR

Un ciclo consiste en tres pasos que se repiten continuamente: desnaturalización, anillamiento o hibridación y extensión o amplificación.

• Problemas en la amplificación:
  1. ¿Cómo conseguir que en cada ciclo de la técnica únicamente se copie el fragmento que nos interesa, entre una mezcla compleja de moléculas de ADN? Diseñar cebadores específicos.
  2. ¿Que no se produzca la inactivación de la ADN polimerasa por la temperatura elevada que es necesaria en la fase de desnaturalización? Usar ADN polimerasas termoestables.

-3´--5´ se denomina cebador F - 5--3´ se denomina cebador R

-Cebadores normal: 18 y 30 bases. - 15 bases: se unen al ADN molde, carecen de especificidad, productos amplificados no específicos.

+30 más especificidad, unirse peor al ADN molde y disminuyen el rendimiento de la reacción.

• Composición de bases: Los mejores resultados se obtienen con cebadores que tienen un contenido en G+C comprendido entre el 40% y el 60%

-ADN polimerasas termoestables monocatenario.

ADNpolimerasa• Realizan su actividad polimerasa a una temperatura óptima comprendida entre 70 ºC y 75ºC. • Tienen capacidad de mantener su actividad polimerasa tras tiempos prolongados de incubación a 95 ºC ¿Por qué la desnaturalización inicial es más larga que la desnaturalización dentro del ciclo? Por la longitud del ADN molde y por asegurarnos que está desnaturalizado al 100%

ADN polimerasas termoestables.Tipos: ▪ Actividad exonucleasa 5´→3´, pero sin actividad exonucleasa 3´→5´. No son capaces de corregir errores.

▪ Actividad exonucleasa 5´→3´y actividad exonucleasa 3´→5´. Son enzimas correctoras, detectan cuando se incorpora un nucleótido erróneo, lo eliminan y continúan la elongación de la cadena.

▪ Actividad transcriptasa inversa.utilizar ARN como molde, es decir, presentan actividad transcriptasa inversa en presencia de iones manganeso (Mn2+ ),

-la PCR se basa en la repetición secuencial de ciclos de replicación. Cada ciclo consta de 3 fases:

- Desnaturalización del ADN molde: debe ser lo suficientemente larga y a una temperatura elevada. se realiza a 94-95 ºC durante 15-30 segundos.

- Hibridación de los cebadores con el ADN molde. El valor concreto depende de la Tm (temperatura de fusión) de los cebadores, Temperaturas de hibridación más elevadas que la Tm de los cebadores implican mayor rigurosidad y, en consecuencia, mayor especificidad. El inconveniente es un rendimiento menor. Temperaturas de hibridación más bajas que la Tm. Mayor rendimiento El inconveniente es la posible aparición de productos no deseados

- Extensión de los cebadores. El tiempo de la fase de extensión está condicionado por la velocidad de polimerización de la enzima y la longitud del fragmento que se va a amplificar.

PRIMER CICLO DE PCR▪ Fase de desnaturalización inicial: se separan las dos cadenas de la molécula de ADN nativa. ▪ Fase de hibridación: cada cebador se une a la secuencia diana.

▪ Fase de extensión: se sintetizan dos nuevas cadenas de ADN, que incluyen el fragmento que queremos amplificar pero que tienen una longitud muy superior, puesto que la ADN polimerasa continua replicando la hebra molde hasta que se inicia la fase de desnaturalización del 2º ciclo.

▪ Resultado final del 1º ciclo: 2 productos no deseados y 0 productos deseados

Los reactivos que se disuelven en el tampón: ─ Cloruro magnésico,─ Desoxinucleótidos trifosfato (dNTP): ─ Cebadores: ─ ADN polimerasa:─ ADN molde

¿Qué significa si observamos varias bandas en el resultado de una PCR? Indica la presencia de productos de ampliación no deseados

-El resultado se analiza mediante una electroforesis en gel de agarosa junto un marcador de tamaños:

➢ una única banda del tamaño adecuado indica que la PCR ha funcionado correctamente. ➢ La observación de varias bandas de distintos tamaños indica la presencia de productos de no deseados, por lo que habrá que repetir la reacción variando

-la observación deuna banda especifica es suficiente para afirmar que la secuencia diana está presente en la muestra que se estudia y garantizar por tanto un resultado positivo.

-¿Cómo descartar que no se trate de un falso positivo? Realizando un control negativo o blanco. Si en el control negativo se detecta alguna banda, ello indicaría contaminación

-Resultado negativo: La ausencia de banda especifica en una muestra problema indica, a priori, que la muestra no contiene la secuencia diana y, por tanto, el resultado es negativo. ¿Cómo descartar que un resultado negativo es debido a reactivos defectuosos o a que existan inhibidores de la PCR? • Realizando un control positivo de la técnica.

-La mayor parte de las polimerasas actuales son hot start.

¿En qué se basa el ciclo de una PCR? Repetición secuencial de ciclos de replicación

¿De cuántas fases consta el ciclo básico de la PCR? 3 ¿Cuántos tipos de cebadores hay? cebador F y cebador R

¿De dónde se aíslan las ADN polimerasas termoestables? De las arqueobacterias termófilas de los volcanes submarinos. ¿Cuál es el inconveniente de que las temperaturas de hibridación sean más elevadas que la Tm de los cebadores? Menor rendimiento

En la fase de desnaturalización inicial…Se separan las dos cadenas de ADN.

Para que las ADN polimerasas termoestables actúen es necesario el uso de: Un cofactor Del primer ciclo de PCR. ¿Cuáles son sus fases? Fase de desnaturalización, fase de hibridación y fase de extensión.

¿Por qué está condicionada la fase de extensión? Por la velocidad de polimerización de la enzima. y Por la longitud del fragmento que se va a amplificar.

¿A qué temperatura se realiza la fase de desnaturalización normalmente?4-95ºC.

-Una mezcla master es una única mezcla de reacción que incluye todos los componentes, excepto el ADN molde. ¿A partir de qué ciclo de la PCR obtengo secuencias concretas de interés ? ) tercer ciclo