Vectores de Clonación, Secuenciación de ADN y Fundamentos de Preparación de Disoluciones

Vectores de Clonación: El Plásmido

Un plásmido es una molécula de ADN circular, de origen bacteriano, que puede replicarse de forma autónoma. Un plásmido diseñado para clonación debe incluir los siguientes componentes esenciales:

1. Origen de replicación (Ori): Permite su multiplicación dentro de la célula hospedadora.

2. Sitio de clonación múltiple (polylinker): Contiene varias secuencias reconocidas por enzimas de restricción, donde se puede insertar ADN extraño.

3. Marcadores de selección:

   • Genes de resistencia a antibióticos (ej. ampicilina, tetraciclina).

4. Marcadores de identificación:

   • Como el gen lacZα, que permite distinguir plásmidos recombinantes de los no recombinantes.

5. (Opcional) Promotor: Si se desea la expresión del gen insertado.

Ejemplos de Plásmidos de Clonación

• pUC18: Alta tasa de replicación (≈500 copias/célula), contiene lacZα y polylinker.

• pBR322: Contiene genes de resistencia a ampicilina y tetraciclina, con sitios de inserción estratégicos.

Sistema de Identificación LacZ (Selección Azul/Blanco)

El sistema LacZ se basa en la expresión de la enzima β-galactosidasa, codificada por el gen lacZα.

Mecanismo de Funcionamiento del Sistema LacZ

1. Se usa un plásmido con lacZα funcional y un polylinker en medio del gen.

2. Si se inserta ADN extraño, el lacZα queda interrumpido (inactivado).

3. Se transforma en bacterias lacZ mutantes (lac−).

Selección en Medio con X-gal

El medio de cultivo contiene el sustrato cromogénico X-gal. La β-galactosidasa hidroliza el X-gal, produciendo un color azul.

• Colonias azules: Tienen plásmido sin inserto (lacZ funcional → produce β-galactosidasa).

• Colonias blancas: Tienen plásmido recombinante con inserto (lacZ interrumpido → no produce la enzima).

Secuenciación de ADN por el Método de Sanger

Es un método enzimático de terminación de cadena (didesoxi). Requiere ADN molde, un cebador, dNTPs (desoxinucleótidos) y ddNTPs (terminadores).

Etapas del Método Clásico de Sanger

1. Reacción de polimerización: Se realiza en 4 tubos, cada uno con un ddNTP diferente.

2. Electroforesis: En gel de poliacrilamida, que separa los fragmentos por tamaño.

3. Autorradiografía o detección fluorescente: Revela las bandas.

4. Lectura: Se deduce la cadena complementaria leyendo la secuencia de abajo hacia arriba.

Variaciones Modernas (Secuenciación Automática)

• Se utiliza un cebador fluorescente o ddNTP fluorescente (cada base con un color distinto), lo que permite realizar la reacción en un solo tubo.

• La detección se realiza automáticamente por láser.

• Es muy útil para leer largas secuencias de forma automatizada.

Preparación de Disoluciones Químicas

Etapas Básicas del Procedimiento

1. Preparación del material: Debe estar limpio, seco y adecuado (balanza, matraces, pipetas, etc.).

2. Cálculo de cantidades: Se utiliza la fórmula química, masa molecular, riqueza y densidad.

3. Medición precisa:

   • Sólido: Con balanza analítica.

   • Líquido: Con material volumétrico clase A o B.

4. Disolución del soluto:

   • Añadir poco a poco el disolvente.

   • ¡Advertencia de seguridad! NO añadir agua sobre ácido o base concentrada, ya que puede generar calor peligroso (siempre añadir el ácido/base al agua).

5. Enrase:

   • Pasar la disolución al matraz aforado y ajustar el volumen con disolvente gota a gota hasta la marca de aforo.

6. Homogeneización: Agitar suavemente o usar un agitador magnético.

7. Etiquetado y conservación:

   • Usar un envase adecuado, opaco si el compuesto es fotosensible.

   • Etiquetar con concentración, fecha, nombre del responsable, etc.

Factores que Influyen en la Velocidad de Disolución

• Solubilidad del soluto.

• Tamaño de partícula (mejor si está pulverizado).

• Agitación (favorece la mezcla).

Diluciones

Las diluciones se rigen por la ley de conservación de la masa (o moles):

Vᵢ × Cᵢ = Vբ × Cբ

Diluciones Seriadas

Se diluye paso a paso con el mismo factor de dilución (ej. 1:2, 1:10).

Son muy útiles para obtener diluciones muy pequeñas (como 1:10.000) de forma precisa.

pH y Disoluciones Ácido-Base

El pH es una medida de la concentración de iones H⁺ (protones) en una disolución acuosa:

$$\text{pH} = -\log[\text{H}^+]$$

Y está relacionado con el pOH por la constante de ionización del agua (Kw):

$$\text{pH} + \text{pOH} = 14$$

• Ácidos: Sustancias que liberan H⁺.

• Bases: Sustancias que liberan OH⁻.

Cálculo del pH

1. Si se tiene la [H⁺] directamente:

   • Ejemplo: si [H⁺] = 0.1 M → pH = 1

2. Si se tiene la [OH⁻]:

   • Calcular pOH = -log[OH⁻] → luego pH = 14 - pOH.

Uso del pHmetro

Componentes del pHmetro

• Electrodo combinado (mide la diferencia de potencial).

• Voltímetro.

• Sonda de temperatura (para compensación).

Pasos de Uso

1. Encender y estabilizar el equipo.

2. Lavar y secar el electrodo (sin frotar, usando papel absorbente).

3. Calibrar (usando soluciones tampón de pH 4, 7 y 10, según el rango de trabajo).

4. Medir el pH de la muestra.

5. Lavar y guardar el electrodo en solución conservante (KCl 3M).