Turbidimetria y nefelometría

TEMA 4. FOTOMETRÍA DE REFLACTANCIA O QUÍMICA SECA :

INTRODUCCIÓN:

El término de química seca se refiere a la presentación de los reactivos que se encuentran embebidos en una matriz en estado seco y no precisa rehidratación antes de su utilización..--..--..Los reactivos se sumergen directamente en la muestra objeto de estudio y esta actúa como solvente (rehidrata los reactivos y permite la reacción)..--..--..El empleo de tiras de papel impregnadas de reactivos es antiguo, por ejemplo, la medición del pH con el papel de tornasol.

_____

Los sistemas de reactivos en química seca comprenden:--

Los sistemas de tiras reactivas

Los sistemas de tiras reactivas están formados por unas tiras de plástico que sirven de soporte a los reactivos que se encuentran en el interior de una matriz (celulosa).--

Sistemas de películas multicapa:

Los sistemas de películas multicapa presentan los reactivos como finas láminas superpuestas_____
La lectura de resultados puede ser:__visual;
cualitativa o semicuantitativa __ fotometría de reflexión;
cuantitativa..--..--..
La química seca se utiliza para facilitar el diagnóstico rápido en UCIs, quirófanos, paritorios, también en screening de orinas, en el control de diabetes, etc.
_____¨Las ventajas que presenta son

:__Facilidad de uso

; basta aplicar la muestra al reactivo en fase sólida para obtener en unos minutos el resultado. Ej. Control de glucemia en diabéticos.__No es necesaria la preparación previa de los reactivos (son reactivos unidad), con lo cual disminuimos manipulaciones que pueden producir errores en el resultado.__Los reactivos son establesmucho tiempo y su almacenamiento es fácil, al contrario de lo que sucede con las técnicas colorimétricas en las que el tiempo de estabilidad del reactivo una vez reconstituido suele ser corta.-.-.-.-
El inconvenientees su elevado precio frente a la espectrofotometría de absorción.

2. FUNDAMENTO:

Cuando un haz de luz incide sobre una superficie, este es reflejado originando dos tipos de reflexión:
__Una reflexión especular, que consiste en que el haz de luz es reflejado con un ángulo de reflexión igual al de incidencia (como por un espejo).__Una reflexión difusa o reflactancia, debida a fenómenos de absorción y dispersión producidos por los distintos componentes de las capas que atraviesa el haz de luz..--..--..Obtenemos un haz de luz que sale de la fase sólida con una intensidad que podemos medir. .-.-.-.-.La relación entre la intensidad de luz reflejada y la intensidad de luz incidente se denomina reflactancia (R).

R = Ir / Io

R = reflactancia Ir = intensidad de luz reflejada Io = intensidad de luz incidente..--..--..La reflactancia la podemos expresar como porcentaje de reflactancia (%R):

% R = ( Ir / Io) . 100 .-.-.-.-

Estas ecuaciones son similares a las que estudiamos en la transmitancia y, como en aquel caso, no guardan una relación lineal respecto a la concentración.-.-.-.Para facilitar los cálculos, es necesario linealizar esta relación, es decir, conseguir una relación lineal entre la concentración y la medida de reflactancia_____
Para establecer una relación lineal entre ambos parámetros, concentración y reflactancia, se recurre a las ecuaciones de Kubelka-Munk y la de Williams-Clapper.
El empleo de una u otra ecuación dependen de la iluminación, carácterísticas de reflactancia del reactivo seco y la disposición de los elementos en el instrumento de medida.

3. ESPECTROFOTÓMETROS DE REFLACTANCIA

:La medida de la reflactancia producida después de la incidencia de luz sobre la muestra situada en el reactivo en fase sólida se realiza, bien mediante la comparación visual del color obtenido con una escala de colores o mediante la utilización de un sofisticado equipo, los espectrofotómetros de reflactancia.
.--..--..
Los espectrofotómetros de reflactancia,que miden la reflactancia y la relacionan con la concentración de la sustantacia. El funcionamiento de los espectrofotómetros de reflactancia es similar a los espectrofotómetros de absorción pero su diseño es más complejo_____
Los espectrofotómetros de reflactancia presentan los siguientes componentes:__
Fuente de luz __Sistemas ópticos__Reactivos en fase sólida-Tiras reactivas -

Películas multicapa o "slides".__Detector y sistemas de lectura_____.Fuente de luz:

Se emplean fundamentalmente 2 tipos de lámparas:__Lámparas de espectro continúo de haluro de tungsteno.__Lámparas de espectro discontinuo como el arco de xenón o un LED (diodos emisores de luz).

Sistemas ópticos:

Consisten en combinaciones de lentes, espejos y filtros o sistemas integrados en forma de esfera cuyo fin es dirigir el haz de luz reflejada al detector para su lectura.

Reactivos en fase sólida:

La muestra se sitúa en los reactivos de fase sólida, bien tiras reactivas o reactivos multicapa
."SLIDES".Todos los componentes necesarios para que se produzca la reacción están impregnados en ellos, y es donde tiene lugar la reacción y la lectura..--..--..La muestra, que contiene el analito a determinar, se aplica sobre la superficie del reactivo en fase sólida y, a partir de esta, difunde a la matriz disolviendo los componentes que contiene y producíéndose reacción_____Los componentes básicos son tres:

__Parte soporte:

lámina de material plástico que sirve de soporte y recubierta de materiales reflectantes que la convierten en capa reflectora.__Parte reflectante:
compuesta por materiales como óxido de titanio, sulfato bárico, óxido de magnesio y óxido de zinc. Su función es reflejar la luz y su carácterística principal es que la absorbancia de luz a la longitud de onda de trabajo sea nula para asegurar máxima sensibilidad.__Parte reactiva:
contiene en forma deshidratada, los reactivos y sustancias auxiliares para que se produzca la reacción. En ocasiones, debido a la complejidad de algunas reacciones y a la incompatibilidad de los reactivos, estos se disponen en forma de capas e incluso se interponen otras capas para separar metabolitos que interfieren en la reacción_____Opcionalmente se pueden añadir otras partes complementarias como:__Capa difusora, cuya función es hacer que la muestra difunda rápidamente hacia los laterales tras su aplicación, consiguiéndose así una distribución uniforme del volumen de muestra por unidad de volumen de reactivo. Suelen ser de membranas o de papel.__Capa separadora de plasma;
en los sistemas para analizar sangre total, su función es retener las células y permitir el paso del plasma hacia la matriz del reactivo. Suele ser de fibra de vidrio.

_____Tiras reactivas:

Consisten básicamente en una lámina de plástico blanca rígida que sirve de soporte a una matriz constituida por fibras como la celulosa impregnada con los reactivos. Si la tira está diseñada para determinar distintos componentes de la muestra, a cada analito le corresponde una zona reactiva diferente. La lectura del resultado se realiza sobre la superficie sobre la que se deposita la muestra.

Películas multicapa o "slides":

Constituidas por diferentes capas, muy finas, a través de las cuales se van produciendo de forma secuencial todas las etapas que llevan a la determinación cuantitativa del analito..--..--..Tienen la apariencia de una diapositiva y están constituidas, básicamente, por cuatro capas de naturaleza gelatinosa que llevan incluidos todos los componentes del sistema y se encuentran enmarcadas en un soporte de poliéster. La lectura se realiza por el reverso de la superficie. El sistema de más amplia implantación es el Ektachem de Kodak .

_____Detector y sistemas de lectura:

La lectura de la reflactancia se puede hacer básicamente por dos procedimientos:

__Lectura sobre la superficie

La muestra se aplica sobre la superficie del reactivo, difunde y se produce la reacción; el color resultante se determina midiendo la reflactancia sobre la superficie. Se emplea en las tiras reactivas.

__Lectura por el reverso de la superficie

La muestra se aplica sobre la superficie del reactivo, difunde y se produce la reacción; la reflactancia se mide sobre el lado opuesto a la superficie. Se emplea en los sistemas multicapas o slides.

4. ASPECTOS PRÁCTICOS:

Los dos sistemas utilizados tienen dos enfoques claramente definidos.
Las tiras reactivas (Seralyzer, de la casa Ames y Reflotron, de la casa Boheringer) van dirigidas a laboratorios con poca carga de trabajo, su manejo y mantenimiento es muy sencillo..--..--..Los sistemas multicapa Ektachem de Kodak se utilizan en laboratorios de gran volumen de muestras a analizar ya que son la base de grandes autoanalizadores..--..--..
Son muy importantes, por su gran utilización, los reflactómetros para el autocontrol de los diabéticos, los que se usan actualmente son slides potenciométricos.

TEMA 8: NEFELOMETRÍA Y TURBIDIMETRÍA:

1.FUNDAMENTO:

Cuando un haz de luz atraviesa una suspensión, parte de la luz es absorbida por las partículas, parte es reflejada, parte es dispersada y parte es transmitida.

Io = Ia + Ir + Id + It __¨La nefelometría y la turbidimetría son técnicas que están relacionadas con la espectroscopia de absorción molecular en el espectro de la luz visible. En ellas se mide la radiación dispersada -
nefelometría-
O la radiación transmitida -

Turbidimetría-

por la muestra que contiene partículas no transparentes en suspensión en el seno de un líquido.-.-.-.

La turbidimetría mide de forma indirecta la radiación bloqueada por las partículas de la muestra, relacionando la intensidad de la luz incidente sobre la muestra y la intensidad de la luz transmitida.
La nefelometría mide la radiación dispersada por las partículas de la muestra, por tanto, el detector se sitúa en ángulos distintos al de la luz incidente.

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La cantidad de luz dispersada depende de varios factores:__concentración de partículas (analito)
__volumen, tamaño, peso y número de partículas __longitud de onda de la radiación incidente __distancia del detector a la cubeta_____
Todos estos factores se relacionan mediante la LEY DE RAYLEIGH, complejas fórmulas matemáticas de las que sacamos las siguientes conclusiones: a) La FORMA en que la luz es dispersada por las partículas, depende de la relación entre EL TAMAÑO de ésta y la LONGITUD DE ONDA de la luz incidente.-.-.-.-. Veamos los modelos de dispersión de forma gráfica: __En ambos casos la intensidad máxima corresponde a la luz dispersada a 180º y 0º en relación al rayo incidente (hacia delante y atrás). Este tipo de dispersión se produce cuando el tamaño de la partícula es menor que la longitud de onda incidente

.

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El tamaño de la partícula es ligeramente inferior a la Y de la radiación incidente.->

Es mucho mayor la luz que se dispersa hacia delante que hacia atrás y, además, no existe simetría.

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El tamaño de partícula es superior a la Y de la radiación incidente.-

La intensidad máxima corresponde al ángulo de 0º. No existe dispersión a 90º y 270º y existe dispersión de poca magnitud hacia atrás.-.-.-.-.Por lo tanto, cuando el tamaño de la partícula es aproximadamente igual a la longitud de onda del haz de luz incidente, la luz aparece dispersada hacia delante en distintos ángulos, lo que favorece las medidas nefelométricas.

_____a)

La FORMA en que la luz es dispersada por las partículas, depende de la relación entre EL TAMAÑO de ésta y la LONGITUD DE ONDA de la luz incidente.


b) La INTENSIDAD de la luz dispersada es:__inversamente proporcional a la cuarta potencia de la longitud de onda, es decir, a menor longitud de onda de excitación, obtenemos mayor sensibilidad en las medidas.__directamente proporcional al peso molecular de las partículas y a su concentración en la solución.__inversamente proporcional al cuadrado de la distancia del detector, por lo que, cuanto mas cerca esté el detector de la cubeta, mayor sensibilidad obtendremos.


_____La TURBIDIMETRÍA es la técnica que mide la disminución de la intensidad de un haz incidente cuando pasa a través de una suspensión de partículas y se mide a 0º del haz incidente (en su misma dirección) . Es decir, mide la intensidad de la luz transmitida, la que no ha sido absorbida, reflejada o dispersada.-.-.-.La disminución de intensidad se puede medir como: __%T o como __absorbancia,por lo que podemos utilizar cualquier espectrofotómetro.-.-.La sensibilidad de la técnica depende del espectrofotómetro.-.-.En la turbidimetría se cumple la ley de Lambert-Beer pero, en la práctica, hay que realizar una RECTA DE CALIBRACIÓN partiendo de las transmitancias de varias disoluciones de concentración conocida y después, por extrapolación, calcular la concentración de la solución problema.

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La NEFELOMETRÍA, es la medida de la luz dispersada por las partículas de la muestra en ángulos distintos al de la radiación incidente, generalmente entre 15 y 90º.-.-.-.La medida se realiza en aparatos especialmente diseñados al efecto, los nefelómetros.-.-.Las técnicas nefelométricas correlacionan las unidades relativas de luz dispersada que se miden en el detector, con las correspondientes a diversas disoluciones de concentración conocida de un analito determinado.

2. INSTRUMENTACIÓN:

1. Fuente de luz:

Pueden utilizarse lámparas de cuarzo, halógenas, xenón, de arco de Mercurio, filamento de tungsteno y láser helio-neón. La ventaja del láser es que emite una radiación de gran intensidad y con un pequeño ancho banda por lo que el aparato no necesita la presencia de colimador debido a que produce haces de luz paralelos

.

2. Colimador-Rendija de entrada

su función es corregir la trayectoria de los haces de luz incidente para que incidan en la muestra de manera paralela evitando la divergencia

.

3. Selector de longitud de onda:

se pueden utilizar filtros o monocromadores; estos tampoco son necesarios si la fuente de luz es láser

.

4. Cubeta

se utilizan las mismas que las de espectrofotometría

.

5. Sistema de detección:

consta de TUBOS FOTOMULTIPLICADORES que pueden ser fijos (más utilizados en clínica) o móviles. Estos últimos adoptan una determinada posición en función del ángulo de detección seleccionado de 0 a 90º. La sensibilidad máxima se alcanza situando el detector posición 0º.

6. Lector:

El detector capta una fracción de la luz dispersada y la convierte en una corriente eléctrica que medimos en unidades arbitrarias de intensidad luminosa. Si el aparato lleva un microprocesador que almacena los datos que procesa, puede emitir los resultados directamente en concentraciones.

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Sensibilidad:

En los nefelómetros la sensibilidad depende de la lectura del blanco -absorción/dispersión de la luz incidente debido a la muestra o a los reactivos utilizados pero no al analito-.

A menor lectura del blanco de reacción mayor sensibilidad.-.-.-

En los turbidímetros, la sensibilidad depende de las carácterísticas fotométricas del aparato, cuanto mayor sea la capacidad de detectar pequeñas variaciones en la absorción, más sensibilidad. _____Interferencias:
Las partículas que se encuentran como componentes del reactivo al igual que las del suero pueden dar origen a una dispersión de la luz que interfiere en los resultados de la técnica como por ejemplo la presencia de lipoproteínas y quilomicrones en sueros lipémicos. La forma de evitar este problema es mediante la utilización de técnicas cinéticas.-.-.-.Igualmente hay que prestar atención a una limpieza cuidadosa de las cubetas y la adecuada conservación y manejo de los reactivos que, en caso contrario, favorecerá la dispersión de la luz y con ello obtendremos resultados erróneos.

Longitud de onda:

El suero contiene, además del analito, otros componentes que absorben luz a determinadas longitudes de onda; por ejemplo, las proteínas tienen un pico de absorción por debajo de 300 nm y los cromógenos del suero entre 400-425 nm. Debido a la presencia de estas sustancias, debemos trabajar con longitudes de onda entre 320-380nm y 500-600nm.-.-.-.En las determinaciones nefelométricas, la dilución del suero reduce la absorción del blanco. Por ejemplo, en las determinaciones basadas en la cuantificación de complejos antígeno-anticuerpo, la utilización de anticuerpos con gran afinidad con el antígeno permite solucionar este problema.

Tipos de análisis:

Se utilizan 2 tipos básicos de medición de la dispersión luminosa en las reacciones antígeno-anticuerpo y se aplican tanto en turbidimetría como en nefelometría. Estas determinaciones son:__Análisis a punto final
:
requiere la utilización del blanco, y debe transcurrir un tiempo prudencial para la determinación final.__Análisis de velocidad o cinético
:
estudia el cambio de velocidad de la reacción y no requiere blanco.-.-.-.En el proceso de formación de complejos antígeno-anticuerpo, encontramos una primera etapa donde la formación del complejo es lenta y no hay casi variación en la dispersión de la luz; en una segunda etapa la dispersión de la luz aumenta rápidamente y finalmente la dispersión se ralentiza permaneciendo casi constante.

Uso de coloides protectores:

En estas técnicas se trabaja con suspensiones con el objetivo de que sean homogéneas y estables. Es aconsejable el uso de coloides como el polietilenglicol, para aumentar la estabilidad en el tiempo de la suspensión y así poder reproducir con exactitud los resultados.