Tecnologías de ADN: Microarrays, Hibridación y Amplificación de Señal

Microarrays: Fundamentos y Fabricación

Microarrays: Conglomerado de ADN distinto fijado a una superficie sólida.

Fabricación

• Depositar sondas en posiciones determinadas del soporte sólido, permitiendo miles de sondas en 2-3 cm.
• Sintetizar las sondas sobre la superficie sólida *in situ* por técnicas fotolitográficas o electroquímicas, permitiendo cientos de miles de sondas en 2-3 cm.

Protocolo General

1. Marcaje de la muestra.
2. Hibridación y lavado.
3. Lectura de microarray (escáner con un láser).
4. Análisis e interpretación de los resultados.

Aplicaciones de los Microarrays

Hibridación Genómica Comparada en Arrays (CGH)

Permite detectar e identificar alteraciones genéticas consistentes en pérdida o ganancia de material genético mediante comparación de ADN de una muestra con ADN de referencia. Se utiliza la siguiente codificación de color:

• Rojo: Deleciones en el ADN problema.
• Amarillo: Genes inalterados.
• Verde: Duplicaciones en el ADN problema.

Estudios de Expresión Génica

Pueden realizarse de dos maneras:

• En términos absolutos: Hibridando en el microarray con el ADNc obtenido a partir de ARNm de una población celular.
• En términos comparativos: Hibridando el microarray con una mezcla de ADNc de la muestra problema y una de referencia marcados con distintos fluorocromos.

Técnica de Captura de Híbrido

Se basa en la formación de híbridos ARN/ADN que serán reconocidos o capturados por anticuerpos inespecíficos.

Pasos de la Captura de Híbrido

1. Lisis de los virus y desnaturalización del ADN.
2. Hibridación.
3. Captura del híbrido.
4. Detección de híbrido.
5. Revelado.

Tecnología del ADN Ramificado (Signal Amplification)

Consiste en un sistema de amplificación de señal basado en la unión de la secuencia diana a un macrocomplejo de ADN de tipo arborescente mediante sucesivas hibridaciones.

Secuencia de Pasos

1. Lisis de las partículas víricas y desnaturalización.
2. Hibridación con sondas específicas: Mezcla de:
   • Sondas para captura: Una parte de la sonda es complementaria a una región del ácido nucleico (a.n.) vírico y otra a un oligonucleótido de captura fijado a la pared de un pocillo de una placa microtiter.
   • Sondas de extensión: Una parte de la sonda es complementaria a una región del a.n. vírico y otra al extremo de un oligonucleótido preamplificador que se utilizará en un paso posterior.
3. Captura del híbrido: La mezcla se transfiere a un pocillo con las paredes recubiertas de oligonucleótidos complementarios de la región que ha quedado sin aparear en la sonda para captura.
4. Preamplificación: Se añade un oligonucleótido preamplificador que constituirá el tronco del sistema de amplificación de señal.
5. Amplificación: Se añaden oligonucleótidos amplificadores que se unirán por sus extremos, constituyendo ramas del sistema de amplificación de señal.
6. Detección: Se añaden oligonucleótidos marcados con fosfatasa alcalina que se unirán a las secuencias repetidas de los oligonucleótidos amplificados, constituyendo las hojas.
7. Revelado: Quimioluminiscente.

Hibridación In Situ: Tipos de Muestras y Características

Características de la Hibridación In Situ

• No requiere extracción y purificación previa de ácido nucleico (a.n.).
• Rápido, sencillo y con coste económico moderado.
• Se puede realizar sobre material fresco, congelado, en formalina o parafina.
• Posibilita la realización de estudios retrospectivos.
• Utiliza sondas no radiactivas.

Preparación de Núcleos Interfásicos Desnudos

Pasos para la Preparación

1. Choque hipotónico (las células se hinchan).
2. Fijación (los hematíes se lisan y los leucocitos se endurecen).
3. Extensión de los núcleos (lavado de leucocitos con Carnoy y se realizan extensiones sobre portaobjetos).