Tecnología PCR: Componentes Esenciales, Enzimas Modificadoras y Optimización de Resultados

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) es un método para la amplificación selectiva de una región elegida dentro de una molécula de ADN. Permite el copiado in vitro de ADN y ADNc, tomando elementos del proceso de replicación del ADN.

Requerimientos de la Reacción de PCR

• DNA Polimerasa

  • Procesividad: Describe la capacidad de una enzima para realizar múltiples ciclos catalíticos en vez de disociarse después de cada ciclo.
  • Proofreading (Corrección de pruebas): Se refiere a cualquier mecanismo para corregir errores en la síntesis que, además, implica una edición de unidades individuales después de que han sido agregadas a la cadena. La fidelidad de la replicación es mejorada por el *proofreading* a un rango de error de <10⁹ por par de base por ciclo de replicación.

• Catión Divalente

  Los iones de magnesio (Mg²⁺) estimulan a la enzima Taq Polimerasa para que incorpore los dNTPs.

• RT-PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Reversa)

  Es similar a la PCR, excepto que permite la amplificación de pequeñas cantidades de ácido ribonucleico (ARN). Se usa para detectar virus con un genoma de ARN y para la detección de transcritos de ARN.

• Oligonucleótidos (Primers)

  Secuencias cortas de ADN (18-25 nucleótidos), moléculas lineales con un grupo hidroxilo en el extremo 3'. Son secuencias complementarias al ADN blanco y se unen al ADN molde de acuerdo a la regla de complementaridad.

• Método de SYBR Green

  El SYBR Green es una tinción que, al igual que el bromuro de etidio, tiñe el ADN intercalándose entre las dos hebras. El SYBR Green solo emite fluorescencia al estar unido al ADN. Como cada ciclo de PCR origina fragmentos nuevos de doble hebra, la cantidad de SYBR Green adherida al ADN es proporcional al número de copias del producto de PCR.

• Buffer

  Mantiene el pH óptimo para que la enzima actúe. Diferentes *buffers* podrían afectar la integridad del ADN molde o los iones disponibles en la reacción.

• Sales

  Proporcionan la fuerza iónica adecuada para una máxima actividad de la enzima. Influyen en la Tm (temperatura de fusión) e hibridación (Ta, temperatura de alineamiento).

Enzimas Modificadoras de ADN

Enzimas que pueden modificar las moléculas de ADN por adición o remoción de grupos químicos específicos. Las más importantes son:

1. Fosfatasa Alcalina (AP)

   Remueve el grupo fosfato presente en el extremo 5' de la molécula de ADN. Ejemplo: Calf Intestinal Alkaline Phosphatase. Usos: Previene la recircularización del plásmido durante el clonamiento.

2. Kinasa Polinucleotídica

   Agrega grupos fosfato en el extremo 5', transfiere γ-PO₄ desde ATP a 5'-OH de ADN o ARN de cadena simple (ss) o doble (ds). Ejemplo: T4 Kinasa.

3. Transferasa Terminal Deoxinucleotídica

   Agrega 1 o más desoxinucleótidos sobre el extremo 3' de una molécula de ADN. Usos: Reacciones para agregar colas de nucleótidos en 3'.

4. ADN Metilasa (dam & dcm)

   Transfieren grupos metilo en residuos internos de Adenina (A) o Citosina (C) en secuencias específicas para producir ADN dúplex metilado.

5. T4 ADN Ligasa / T4 ARN Ligasa

   Une extremos romos y/o cohesivos, y repara roturas de cadena simple (nicks) en dúplex de ADN, ARN o híbridos ADN/ARN.

   • T4 ADN Ligasa: Usada en clonamiento.
   • Requiere ATP, Mg²⁺ y DTT.
   • Amplio rango de temperatura, óptima a 25 ºC.
   • Inhibida por alta concentración de sal (ej. 150 mM NaCl).

Verificación de Amplicones en Gel de Agarosa: Resolución de Problemas

• No hay amplificación

  • Poco ADN molde.
  • ADN degradado.
  • La enzima no funciona.
  • dNTPs o primers degradados.
  • Inhibidores de PCR en la reacción.
  • Inadecuada concentración de MgCl₂.

• Se observa un barrido

  • Exceso de ADN.
  • Temperatura de alineamiento demasiado baja.

• Bandas no específicas

  • Temperatura de alineamiento demasiado baja.
  • Solución: Incrementar la temperatura de alineamiento hasta donde lo permita la Tm de los oligos.

• Contaminación

  • El control negativo presenta banda(s).

PCR en Tiempo Real (qPCR)

El ensayo de PCR con nucleasa 5' fluorogénica (conocido como PCR en tiempo real o qPCR) es un ensayo sensible y específico capaz de cuantificar los productos de PCR. Al igual que en otros ensayos de PCR, también puede ser modificado para cuantificar el ARN. La qPCR está ganando popularidad en laboratorios de diagnóstico y medicina animal debido a su capacidad de detectar cantidades minúsculas de ácido nucleico de agentes extraños. Es también útil para el estudio de la expresión génica y para determinar alteraciones genéticas, como la variación alélica.